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Recolección masiva de fracciones de productos naturales: ejemplos de extracto de cúrcuma y té verde

Introducción

Los productos naturales han sido una fuente de inspiración para el descubrimiento de fármacos preclínicos tanto para explorar las medicinas tradicionales como para descubrir nuevos espacios en la farmacología. El aislamiento y la caracterización de productos naturales sigue siendo una barrera importante en el descubrimiento de fármacos. El aislamiento generalmente se realiza a escala analítica y luego los compuestos se caracterizan completamente antes de intentar cualquier purificación a escala. La capacidad de purificar compuestos en mezclas complejas de productos naturales mediante datos de MS altamente específicos permite simplificar los pasos de purificación y caracterización del proceso. Aquí, la cromatografía flash y de preparación se combinan con la detección de MS para purificar productos naturales en extractos de té verde y cúrcuma. 

Métodos

El aislamiento de las principales catequinas del té verde y los principales curcuminoides de la cúrcuma se completó mediante extracciones. Se extrajeron hojas de té verde y el material crudo se analizó mediante UPLC-MS y estándares analíticos para identificar las catequinas de interés y desarrollar un método de prep-LC adecuado para el aislamiento. El polvo de cúrcuma se extrajo y luego se analizó por TLC-MS usando Advion's Plate Express™ para identificar los compuestos de interés y desarrollar un método de cromatografía ultrarrápida adecuado para el aislamiento. Ambos extractos se purificaron utilizando la recolección de fracciones dirigidas a la masa utilizando el sistema de cromatografía flash/prep puriFlash 5.250 de Interchim conectado al ex de Advion.prensaion® espectrómetro de masas de un solo cuadrupolo. Los compuestos objetivo se detectaron usando canales XIC MS. A continuación, se determinó la pureza de los compuestos aislados usando HPLC-MS.

Datos preliminares

Pudimos aislar con éxito los 3 curcuminoides principales (curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina) en la cúrcuma y las 5 catequinas principales en el té verde ((-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epicatequina (EC), (-) -epigalocatequina-3-galato (EGCG), (-)-epicatequina-3-galato (ECG) y (-)-galocatequina galato (GCG) con alta pureza (≥95%).   

Se desarrolló un método de cromatografía ultrarrápida isocrática (97:3 DCM:MeOH) usando TLC (97:3 DCM:MeOH) para purificar los curcuminoides. La placa de TLC fue analizada por APCI– MS utilizando Plate Express, que extrae manchas directamente de la placa sin necesidad de preparación de la muestra. Las fracciones se recolectaron utilizando canales de cromatograma de iones extraídos (XIC) con APCI– SRA. Luego se caracterizaron las fracciones por ASAP– La MS y la pureza de cada fracción se determinaron usando HPLC-MS. 

Se desarrolló un método de CL preparativo para las catequinas del té verde utilizando HPLC-MS y estándares de referencia para identificar cada compuesto de interés. Usando un gradiente de metanol en agua y recolectando fracciones usando canales XIC establecidos para los compuestos de interés. Las fracciones se caracterizaron y su pureza se determinó por HPLC-MS. Se determinó que las fracciones de EGC, EGCG, GCG y ECG tenían purezas del 100 %, 99.8 %, 98.8 y 100 %, respectivamente.

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Presentamos el ICP-MS SOLATION® de Advion Interchim Scientific

Introducción

La SOLACION® El espectrómetro de masas de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) pone en sus manos el poder del análisis multielemental de trazas al simplificar y optimizar el flujo de trabajo típico de ICP-MS, por dentro y por fuera. El sistema ofrece análisis multielemental de alto rendimiento, ideal para aplicaciones medioambientales, clínicas, biomédicas, alimentarias, agrícolas y geológicas.   

La SOLACION® ofrece un deflector de cuadrupolo de última generación que garantiza que el analizador y el detector permanezcan limpios y mejora la S/N al evitar que los neutros y las partículas entren en el analizador. El sistema también está diseñado para un menor consumo de argón. 

La infraestructura clave del sistema incluye:

  • Conos de extracción de iones: extracción de iones de triple cono, seguida de una lente Einzel, que se controlan eléctricamente para maximizar la transmisión de iones al sistema de vacío. 
  • Bobina de RF: Generación de plasma con bobina de RF enfriada por agua que utiliza un generador de frecuencia variable estándar de la industria de 27 MHz para una adaptación rápida de la impedancia y el máximo rendimiento con matrices desafiantes. 
  • Antorcha: Antorcha desmontable de una pieza con conexión rápida en un solo paso de argón y encendedor. Escudo opcional para evitar descargas secundarias. 
  • Nebulizador: Nebulizador concéntrico de alta eficiencia disponible en vidrio o cuarzo para compatibilidad con la gama más amplia de caudales y composición de muestras. 
  • Cámara de pulverización: la cámara de pulverización ciclónica con control de temperatura opcional reduce aún más el tamaño de las gotas y la carga de disolvente para garantizar un plasma estable y eficiente. 
  • Bomba peristáltica: Bomba integrada de 4 canales y 12 rodillos para máxima flexibilidad y pulsaciones ultrabajas. Velocidad de flujo controlada por software de 1 μL/min a >1 mL/min. 
  • Válvula de compuerta: Permite un mantenimiento y reemplazo rápido y fácil de los conos mientras mantiene la integridad del vacío. 
  • Deflector de cuadrupolo de 90°: asegura que el analizador y el detector no estén alineados con el haz de plasma, lo que evita que los neutros y las partículas entren en el analizador, mejora la S/N y evita la contaminación. 
  • Celda de colisión octupolar: actúa como una guía de iones y una celda de colisión con gas He para proporcionar Discriminación de energía cinética (KED) para eliminar interferencias. 
  • Analizador de cuadrupolo: diseño de filtro de masa de alta frecuencia con la mayor estabilidad para maximizar simultáneamente la transmisión, la resolución y la sensibilidad de abundancia. 
  • Detectores de doble función: Mide tanto en modo analógico como de detección de pulsos con transmisión continua entre los dos, para permitir la medición de niveles altos y bajos en un solo análisis con más de 9 órdenes de magnitud de rango dinámico lineal. 
  • Detección de pulso: captura iones que generan pulsos de menos de 20 ns; preciso y lineal a un tiempo de permanencia mínimo de menos de 100 μs 
  • Detección analógica: se utiliza para señales de iones más altos mientras que la detección de pulsos está desactivada para prolongar la vida útil del detector. 
  • Control de software dependiente de la masa: software diseñado para optimizar rangos de masa específicos de forma independiente para permitir la optimización de sintonía específica de masa.  

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Análisis de metales pesados ​​en cannabis mediante SOLATION® ICP-MS

Instrumentación: SOLATION® ICP-MS

INTRODUCCIÓN

Con la creciente aceptación y legalización del cáñamo y el cannabis en los EE. UU., Canadá y varios otros países, los productos de cannabis están más disponibles que nunca. Ahora aprobado para usos médicos, recreativos y de suplementos de salud, el aumento de la producción y el consumo han puesto de relieve la necesidad de realizar pruebas de rutina y desarrollar estándares de prueba para sustancias químicas tóxicas, incluidos metales pesados, en el material vegetal de cannabis y todos los subproductos elaborados a partir de ellos, para garantizar productos seguros para el consumidor.  Con la adopción de los capítulos <232> y <233>, la Farmacopea de EE. UU. (USP) especifica una lista de elementos y límites de exposición máxima basados ​​en la toxicidad y las vías de administración de los productos farmacéuticos.  

Muchos estados que han legalizado el cannabis medicinal y recreativo basan sus límites de exposición en los valores de la USP.  California, Colorado y Massachusetts son ejemplos con límites de exposición diaria permitida (PDE) por inhalación de As, Cd, Hg y Pb. Estos valores se resumen en la Tabla 1. 

Tabla 1: Límites de PDE para los estados que utilizan las pautas de la USP para la exposición a metales pesados ​​por inhalación. USP <233> también define la precisión, repetibilidad y solidez requeridas para el análisis de estos elementos tóxicos:

Criterios de validación

Precisión: La matriz y los materiales bajo investigación deben enriquecerse con elementos objetivo en concentraciones que sean 50%, 100% y 150% de la exposición diaria máxima permitida (PDE). Las recuperaciones de picos medios para cada elemento objetivo deben estar dentro del 70% -150% del real.

Repetibilidad: Se deben agregar seis muestras independientes del material bajo investigación al 100% de los límites objetivo definidos y analizados. La desviación estándar relativa porcentual medida (% RSD) no debe exceder el 20% para cada elemento objetivo.

Rugosidad: Realización del procedimiento de prueba de medición de repetibilidad analizando las seis soluciones de prueba de repetibilidad, ya sea en días diferentes, con un instrumento diferente o por un analista diferente. El% RSD de las 12 réplicas debe ser inferior al 25% para cada elemento objetivo.

En este estudio, utilizamos Advion SOLATION® ICP-MS y un sistema de digestión por microondas para digerir y analizar muestras de cáñamo utilizando los métodos de validación descritos en el Capítulo General de la USP <233>.  La sensibilidad, la capacidad de manejar matrices complejas y la capacidad de eliminar las interferencias con una celda de colisión de helio lo convierten en el sistema ideal para el análisis de metales pesados ​​en la industria del cannabis.

EXPERIMENTAR

Preparación de la muestra

Se compró localmente una muestra de flor de cáñamo medicinal.  Aproximadamente 14 gramos se molieron finamente y se homogeneizaron, luego se pesaron 0.5 g +/- 0.005 g en recipientes de digestión y se añadió la cantidad apropiada de una solución de picos.  Se agregaron nueve ml de HNO3 concentrado y 1 ml de HCl concentrado a cada recipiente y las muestras se dejaron reaccionar durante 15 minutos antes de sellar y colocar los recipientes en el plato giratorio del sistema de digestión por microondas de recipiente cerrado.  El programa controla la energía de microondas de tal manera que las muestras aumentan hasta la temperatura de digestión óptima de 200 ° C durante 20 minutos, se mantienen a 200 ° C durante 10 minutos y luego se enfrían de nuevo a temperatura ambiente.  

Este método dio como resultado la digestión completa de todas las muestras, lo que dio como resultado una solución transparente y sin partículas una vez que se llevó al volumen con agua de 18 MΩ en un matraz aforado de 50 ml.

Los estándares de calibración y los picos se basaron en los niveles de acción de la tabla 1.  El conjunto de muestras incluyó una muestra de cáñamo, un duplicado, los picos del 50%, 100% y 150%, y agujas de pino NIST 1575 para validar aún más los resultados, que se ejecutaron por duplicado.  Para la especificación de 'robustez' de la USP <233>, hubo 6 muestras del cáñamo 100% enriquecido.  Los valores de los picos se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Valores de pico basados ​​en los límites de acción definidos en USP <233>

Se realizó una segunda dilución 1: 4 después de la digestión para llevar la concentración de ácido final al 5% para un factor de dilución total de 400x.  El blanco de calibración y los estándares se prepararon utilizando la misma concentración de ácido, 5% de HNO 9: 13/ HCl, para el emparejamiento de matrices.  Para estabilizar el mercurio y ayudar con el lavado, se agregó oro a 20 veces la concentración de mercurio.  Los estándares internos se agregaron a todas las muestras, estándares y blanco para una concentración final de 10 ng / g (ppb).  Las concentraciones estándar y los estándares internos se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Analizar masas, patrones de calibración y patrones internos.

Instrumentación

La SOLACIÓN Advion® ICP-MS incorpora un generador de estado sólido robusto, óptica iónica ortogonal para mantener limpios los componentes más sensibles de MS y un software de control y procesamiento de datos fácil de usar. 

Dado que se utilizó HCl en la digestión de la muestra, hay una cantidad significativa de cloro presente que crea una interferencia isobárica en 75A partir de 40Ar35Cl+.  La celda de colisión elimina efectivamente la contribución que ArCl+ hace a la señal en m / z 75 aprovechando la discriminación de energía cinética (KED) para separar las interferencias poliatómicas de los iones del analito, lo que da como resultado una cuantificación precisa de niveles bajos de arsénico.  El arsénico es el único analito del conjunto con este tipo de interferencia, por lo que la celda de colisión no se usa para Cd, Hg o Pb.  

Para la introducción de la muestra se utilizó un nebulizador concéntrico de vidrio acoplado a una cámara de pulverización ciclónica, conectado a la antorcha estándar con un diámetro interior del inyector de 2 mm.  Los parámetros de funcionamiento del instrumento se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Parámetros de ICP-MS

RESULTADOS Y VALIDACIÓN

Resultados de muestra

Las concentraciones de mercurio y plomo en el cáñamo fueron menores que el estándar más bajo y todos los valores fueron menores que los límites de acción. Las muestras se prepararon y analizaron por duplicado, y el promedio de esos duplicados se muestra en la Tabla 5. De acuerdo con el requisito de robustez, las muestras se analizaron en días separados por dos analistas diferentes.

Tabla 5: Resultados de la muestra de cáñamo (promedio de la muestra y duplicado)

Precisión: Las muestras se enriquecieron al 50%, 100% y
150% del nivel de acción (Tabla 2 anterior) y el porcentaje de recuperaciones calculado. Las recuperaciones de picos estuvieron todas entre 92.5% y 114.1%, muy dentro del rango de 70-150% definido por el método USP.

Tabla 6: Precisión: recuperaciones de picos

Repetibilidad: Se añadieron seis muestras de cáñamo al 100% del nivel de acción y se digirieron. Los resultados que se resumen en la Tabla 7 muestran que el% RSD de las concentraciones medidas están entre 1.3% - 3.7%, lo que demuestra una repetibilidad muy por debajo del límite del 20%.

Tabla 7: Resultados de repetibilidad USP <233>

Rugosidad: El conjunto de muestras de repetibilidad fue preparado y analizado en un día diferente por un analista diferente. Los resultados de esa ejecución se combinan con la ejecución anterior para determinar la robustez. Los valores de robustez son similares a los valores de repetibilidad y el% RSD medido (2.4 - 4.0%) está cómodamente por debajo del límite del 25% definido por el método USP. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8: Resultados de robustez de USP <233>

Resultados de NIST 1575a

Los resultados del NIST SRM se resumen en la Tabla 9. Los valores de As y Hg fueron menores que
el estándar bajo en solución, pero existe una buena concordancia entre los valores experimentales y los valores certificados.

Tabla 9: NIST 1575a agujas de pino SRM

CONCLUSIÓN

Este estudio demuestra que Advion SOLATION® ICP-MS, junto con un sistema de digestión por microondas, es adecuado para el análisis preciso, robusto y reproducible de metales pesados ​​en material vegetal de cáñamo, superando en gran medida los requisitos del protocolo USP <233>.

La validación del método de digestión por microondas se vio reforzada por los excelentes resultados de recuperación obtenidos para el pino NIST SRM 1575.

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Análisis directo de muestras de bebidas gaseosas sin preparación de muestras en un espectrómetro de masas compacto

Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: lo antes posible

INTRODUCCIÓN

Los químicos tienen la tarea de identificar rápidamente los compuestos creados, garantizar la calidad de los productos o evaluar la seguridad. Las técnicas actuales son adecuadas, pero no todas ofrecen la velocidad, la calidad de los datos o la facilidad de uso que ofrece Advion exprensaion® CMS. El CMS con Advion ASAP ofrece a los químicos la capacidad de analizar rápidamente sólidos, líquidos y polvos sin la tediosa y lenta preparación de muestras.

MÉTODO

El capilar de vidrio extendido del ASAP se sumergió en cada muestra de bebida gaseosa. El exceso se eliminó y la sonda se insertó directamente en la fuente de iones APCI habilitada para ASAP del CMS, produciendo resultados en segundos.

Figura 1 y XNUMX: El ASAP que contiene la muestra directamente insertada en la fuente APCI habilitada para ASAP del CMS para su análisis.

Figura 2 y XNUMX: Esquema de la sonda de muestreo ASAP para análisis APCI-CMS.

RESULTADOS

RESUMEN

El análisis ASAP / CMS proporcionó datos en <1 min sin preparación de muestras ni cromatografía, lo que lo hace ideal para el monitoreo de reacciones, identificación de compuestos, seguridad alimentaria y análisis de productos naturales.

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Clasificación de quesos por espectrometría de masas compacta APCI volátil (vAPCI)

Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: vAPCI

INTRODUCCIÓN

El queso es uno de los tipos de alimentos más populares del mundo, con una amplia variedad disponible para los consumidores. Comúnmente comemos quesos de vaca, cabra y oveja. Los aromas y sabores de los quesos, tan característicos de cada tipo de queso, provienen de una compleja mezcla de sustancias químicas, entre las que se encuentran los ácidos grasos libres. Si bien esta mezcla se ve afectada por una amplia variedad de factores, podemos utilizar los espectros de masas para caracterizar los perfiles volátiles de diferentes tipos de quesos.

Figura 1 y XNUMX: (A) Queso de cabra, (B) Blue Stilton, (C) Red Leicester, (D) Wensleydale.
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Figura 2 y XNUMX: Esquema del sistema de entrada de la fuente vAPCI.

En esta nota de aplicación, demostrar la capacidad del Advion exprensaion® CMS para analizar los ácidos grasos volátiles de varios tipos de quesos utilizando nuestra fuente de iones volátiles APCI (vAPCI). Al calentar las muestras de queso, liberamos varios compuestos volátiles, principalmente ácidos grasos, y analizamos el espacio de cabeza sin ninguna preparación ni derivatización de la muestra. Luego realizamos staanálisis estadístico para agrupar las muestras de queso por sus diferentes perfiles volátiles.

 

FORMAS DE PAGO

Varios quesos de diferentes tipos se calentaron en recipientes a 70 ° C durante 2 horas, y los espacios de cabeza de los recipientes se analizaron usando el CMS con una fuente de iones vAPCI, usando un flujo de solvente (10 mM4NH4OAc en 1: 1 MeOH: H2O) para ayudar en ionización.

Si bien las muestras de queso contenían muchos de los mismos ácidos grasos, los iones invisibles a simple vista proporcionarán la información necesaria para separar los perfiles de cada queso. Para buscar estas diferencias, realizamos un análisis de componentes principales (PCA) en los espectros de masas.

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Figura 3 y XNUMX: Una selección de ácidos grasos que se encuentran comúnmente en diferentes quesos.

RESULTS AND DISCUSSION

Los espectros de masas muestran que una amplia variedad de ácidos grasos evolucionan de cada una de las muestras de queso cuando se calienta (Figura 3). Cada muestra de queso contenía muchos de los mismos ácidos grasos (Tabla 1).

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Figura 4 y XNUMX: Espectros de masas de muestras representativas de cuatro tipos de queso: (A) queso de cabra, (B) Blue Stilton, (C) Red Leicester y (D) Wensleydale.

Tabla 1: Ácidos grasos observados mediante el análisis vAPCI de muestras de queso.

PCA es una herramienta estadística que se utiliza para buscar patrones en los datos. El gráfico resultante (Figura 6) muestra la agrupación en función de qué tan similares o diferentes son las muestras entre sí. Al realizar PCA en los datos de varias muestras de cada tipo de queso, encontramos que los diferentes quesos de hecho se pueden agrupar en función de sus espectros de masas, lo que permite una identificación rápida mediante el análisis de vAPCI. Por ejemplo, los distintos quesos de cabra tenían espectros estadísticamente similares y, por lo tanto, se agrupan en el gráfico PCA. En general, esto es cierto para cada tipo de queso.

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Figura 6 y XNUMX: PCA de perfiles volátiles de queso.

Los espectros de masas de cada tipo de queso fueron característicos; no solo los espectros de las muestras de queso eran similares dentro de cada tipo de queso, sino que eran sustancialmente diferentes entre los diferentes tipos de quesos analizados.

CONCLUSIONES

Usamos el Advion exprensaion® CMS con una fuente de iones vAPCI para analizar los ácidos grasos en vapor emitidos por las muestras de queso calentado sin ninguna preparación o derivatización adicional de la muestra. Además, utilizamos PCA para mostrar que el espectro de cada tipo de queso es característico de ese tipo de queso, lo que nos permite clasificar las diferentes muestras de queso por su tipo. Además, esto nos permitiría identificar los quesos por su tipo utilizando una configuración de espectrometría de masas volátil simple.

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Análisis de compuestos volátiles en la fermentación de cerveza

Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: vAPCI

INTRODUCCIÓN

El análisis químico de bebidas alcohólicas es un paso importante en el control de calidad, ya que se utiliza para monitorear los perfiles de sabor en los lotes, estudiar los cambios químicos en el producto a lo largo del tiempo e identificar la fuente de cualquier problema (por ejemplo, sabores desagradables).

El complejo sabor de la cerveza es principalmente el resultado de los ingredientes utilizados, el método de elaboración y las condiciones durante la fermentación, y el análisis de la cerveza a lo largo de este proceso puede ser invaluable para monitorear la fermentación y establecer el punto en el que ocurren los problemas. Al ser una de las bebidas más consumidas en todo el mundo, las técnicas analíticas rápidas y confiables son esenciales para mantenerse al día con la demanda y la producción.

La cromatografía de gases o de líquidos y la espectrometría de masas (GC / MS o LC / MS, respectivamente) se utilizan tradicionalmente para el control de calidad en la industria de bebidas y bebidas espirituosas; sin embargo, estas técnicas pueden llevar mucho tiempo y no necesariamente son ideales para un análisis rápido y de alto rendimiento.

MÉTODO

Figura 1: Advión exprensaion® CMS con línea de transferencia de calor vAPCI.page2imagen34676944

Figura 2: Esquema de vAPCI / CMS.

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Se recolectaron alícuotas de la cerveza casera (1 mL) y se analizaron a las 12 horas, 4 días y 14 días del proceso de fermentación, además de hojas de lúpulo en mosaico (1 g). La cerveza casera también contenía lúpulos simcoe y citra, que no fueron analizados.

Cada alícuota se selló en un vial de vidrio y se calentó a 70 ° C durante 10 minutos. El espacio de cabeza fue atraído directamente al CMS por el efecto Venturi de la fuente de vAPCI para su análisis. Las muestras se analizaron en modo de iones positivos en un rango de 30-300 m / z, con un tiempo de exploración de 400 ms.

RESULTS AND DISCUSSION

Figura 3: Espectros de masas del espacio de cabeza de cerveza casera a (A) 12 horas, (B) 4 días y (C) 14 días) en fermentación.

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Hubo cambios distintos en el perfil volátil general, notablemente el aumento gradual en el ión m / z 93, probablemente el dímero de etanol protonado (Figura 3). La concentración de estos iones se estabilizó en el punto de tiempo de 4 días, lo que demuestra que la fermentación se produjo principalmente en los primeros días.

Figura 4: Espectro de masas de lúpulo mosaico, añadido 4 días de fermentación.

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También se analizó el espacio de cabeza de los lúpulos de mosaico utilizados en esta cerveza casera. El espectro de masas del lúpulo (Figura 4) estuvo dominado por iones en m / z 81, 137 y 273, todos los cuales son iones comunes asociados con los terpenos, una clase de compuestos responsables de muchos de los aromas y sabores del lúpulo. Muchos de estos compuestos tienen los mismos pesos moleculares y, por tanto, sería necesario un análisis adicional para diferenciar e identificar estos componentes. Los componentes derivados del lúpulo se detectan fácilmente en las alícuotas de cerveza, particularmente después del punto de tiempo de 4 días, cuando se agregaron lúpulos adicionales.

CONCLUSIONES

Este estudio demuestra el uso de Advion exprensaion® CMS con vAPCI para el análisis de compuestos volátiles del espacio de cabeza de la cerveza casera y el lúpulo. La interfaz asistida por Venturi del instrumento permitió un muestreo rápido de volátiles, lo que permitió observar el perfil volátil cambiante de la cerveza casera durante todo el proceso de fermentación. Este método simple sería adecuado para un control de calidad rápido durante la producción de bebidas alcohólicas.

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Muérdago: ¿Beso de amor o muerte? Uso de cromatografía de capa fina con espectrometría de masas compacta

Muérdago

Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: Plate Express ™ 

 En el espíritu de la temporada navideña y para garantizar que los besos de muérdago se disfruten y sean 'no tóxicos', empleamos el Advion Interchim Scientific exprensaion® El espectrómetro de masas compacto (CMS) y el lector de placas Plate Express ™ TLC para analizar una tintura comercial de extracto etanólico de muérdago para determinar si la tiramina está presente en el extracto de muérdago. 

INTRODUCCIÓN 

Una ramita de muérdago simboliza una tradición de romance (Figura 1) y tiene un legado de folclore que afirma que los extractos de muérdago pueden curar el cáncer junto con una larga lista de otros beneficios para la salud reportados. Sin embargo, el muérdago también se considera letal. Algunos dicen que el muérdago, que tiene fama de ser el "beso de la muerte", es tan venenoso que los humanos pueden morir si ingieren las hojas o las bayas. 

Figura 1: La tradición del muérdago.
Muérdago

La toxicidad reportada nos hizo preguntarnos, ¿por qué o cómo pueden los vendedores vender extractos de muérdago para consumo humano intencional? Una especie de muérdago, Viscum, contiene el alcaloide venenoso tiramina, que puede causar visión borrosa, náuseas, dolor abdominal, diarrea, cambios en la presión arterial e incluso la muerte. Una búsqueda de literatura científica revisada por pares revela una escasez de apoyo analítico creíble para la presencia de tiramina en el muérdago. 

En el espíritu de la temporada navideña y para garantizar que los besos de muérdago se disfruten y sean 'no tóxicos', empleamos el sistema Advion Interchim Scientific TLC / CMS (Figura 2) para analizar una tintura comercial de extracto etanólico de muérdago para determinar si la tiramina está presente en el extracto de muérdago.

Figura 2: Configuración experimental de Advion Interchim Scientific exprensaion® CMS con el lector de placas Plate Express™ TLC.
CMS y Plate Express
Figura 3: Hierbas experimentales utilizadas.
Hierba de muérdago

EXPERIMENTAL 

Se compró una tintura de muérdago de Indigo Herbs. Una pequeña alícuota de esta muestra de tintura se derivatizó con cloruro de dansilo a 50 ºC durante 30 min de acuerdo con procedimientos bien conocidos.[ 1 ]. De manera similar, una muestra auténtica de tiramina se derivatizó de la misma manera para formar su derivado dansilo. 

Se aplicó una pequeña alícuota (10 ml) del derivado estándar de tiramina dansilo a los carriles exteriores (carriles 1 y 4) de una placa Merck Silica gel G TLC. Se aplicó una alícuota de la tintura derivatizada de muérdago al carril 2 y se aplicó una tintura derivatizada de muérdago enriquecida con derivado de tiramina dansilo al carril 3 (Figura 4). 

Figura 4: Placa de TLC después del revelado y visualización bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga. Carriles 1 y 4: Derivado de dansilo de tiramina estándar. Carril 2: Mezcla de reacción de derivado de dansilo de muestra de tintura de muérdago. Carril 3: Extracto de tintura de derivado de dansilo con un derivado de dansilo de tiramina estándar añadido. (A) Rf = 0.3 para el derivado de tiramina dansilo. (B) Rf = 0.6 para cloruro de dansilo.
Resultados de muérdago

La placa de TLC secada al aire se reveló en un tanque de disolvente equilibrado que contenía cloroformo/acetato de etilo (8/2, v/v). A continuación, la placa de TLC revelada se observó bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga para revelar los componentes separados (Figura 3). La placa de TLC se colocó en el lector de placas de TLC Plate Express™, después de lo cual cada "mancha" de TLC pudo analizarse individualmente mediante TLC/CMS. 

Con referencia a la Figura 4, el análisis de TLC / CMS mostró fácilmente que los puntos de Rf 0.3 en los dos carriles exteriores (carriles 1 y 4) producían un espectro de masas con un abundante m / z 371 consistente con la molécula protonada esperada del derivado de tiramina dansilo (Figura 5A). Los espectros de masas de TLC / CMS obtenidos de los puntos con un Rf = 0.6 observados en los carriles 1 y 4 fueron consistentes con cloruro de dansilo sin reaccionar con una molécula protonada en m / z 270 (datos no mostrados). El análisis de TLC / CMS de la mancha en el carril 2 a Rf = 0.3 no mostró evidencia de la presencia de derivado de tiramina dansilo (Figura 5B). 

Figura 5: (A) Espectro de masas de TLC / CMS del derivado de dansilo de tiramina estándar observado a Rf = 0.3 en la Figura 4 Carril 1. (B) Espectro de masas LC / CMS de tintura derivatizada de muérdago observado a Rf = 0.3 en la Figura 4 Carril 2. 

Espectros de muérdago

En ausencia de análisis de TLC / CMS, sería lógico concluir que la mancha en Rf = 0.3 en el carril 2 se debió a la presencia de tiramina en la muestra de tintura de muérdago. La mancha Rf = 0.3 observada para el extracto de tintura reforzada en el carril 3 de la Figura 4 mostró fácilmente el mismo espectro de masas para el derivado de tiramina dansilo que se muestra en la Figura 5A. Los mismos resultados negativos para la tiramina se obtuvieron del extracto alcohólico del producto de hoja de muérdago. 

CONCLUSIONES 

Los resultados de este breve estudio sugieren que el nivel de tiramina en la muestra de tintura es muy bajo y está por debajo de nuestros límites de detección o que la tiramina no está presente en la muestra. Es común que los químicos forenses y sintéticos empleen técnicas de TLC como una pantalla rápida y fácil de una muestra para determinar la presencia de una sustancia química esperada. La comparación con una muestra conocida, que muestra el mismo valor de Rf, proporcionará a menudo cierta confianza para informar la presencia del compuesto esperado. Sin embargo, como sugiere este ejemplo, un valor de Rf similar no garantiza la confirmación de la identidad del lugar cuando tiene el mismo valor de Rf. Como se muestra aquí, acceda al análisis directo del spot con el Advion Interchim Scientific exprensaion® CMS puede corroborar la identificación esperada o, como en este caso, sugerir que la mancha con el mismo valor de Rf NO es el compuesto esperado. Estos resultados pueden explicar por qué las muestras comerciales de tintura de muérdago no son dañinas para fines medicinales. ¿Entonces, qué debería hacer? El muérdago no es mortal. Pero puede ser peligroso, así que no lo coma. ¡Solo 'roba un beso debajo de él'! 

REFERENCIAS Y AGRADECIMIENTOS 

[ 1 ]Mullins, Donald E. y Eaton, John L. Cromatografía cuantitativa en capa fina de alto rendimiento de derivados dansilo de aminas biogénicas, Anal. Biochem., 1988, 172, (484 - 487). 

Gracias al Jefe Elf, Nigel Sousou, Ph.D., por liderar el proceso de análisis de muestras. 

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PuriFlash-MS Aislamiento específico de productos naturales en condiciones de fase normal

Introducción

La mejora de las técnicas analíticas y las herramientas metodológicas juega un papel importante en la caracterización y aislamiento de metabolitos secundarios bioactivos en la investigación de productos naturales. La cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas (RP-LC-MS) se utiliza ampliamente para la elaboración de perfiles de metabolitos de extractos naturales complejos a nivel analítico y se utiliza cada vez más para el aislamiento selectivo de biomarcadores por EM. La cromatografía de fase normal (NP-LC) es muy adecuada para la purificación de metabolitos secundarios polares y ofrece también algunas ventajas en comparación con la RP, como presiones de funcionamiento bajas y fases estacionarias más baratas.

Sin embargo, NP-LC no suele ser adecuado para el acoplamiento de MS. El potencial de NP-LC-APCI-MS para la purificación de metabolitos a escala preparativa utilizando métodos de separación genéricos se ha investigado en un Advion X Interchim PuriFlash® - sistema CMS en vista de su aplicación para el aislamiento selectivo de MS de metabolitos secundarios lipofílicos. Se utilizó una mezcla de tres productos naturales apolares representativos para optimizar la separación, la escisión y la ionización por EM en condiciones que imitan los casos de aislamiento reales. Finalmente, se realizó un aislamiento exitoso de los constituyentes apolares del extracto de raíces de diclorometano de Angelica archangelica.

Aislamiento rápido de una mezcla representativa de productos naturales apolares mediante Flash-CMS en fase normal

Purificación de una mezcla de productos naturales en columnas flash de fase normal de 12 gy 25 g

Se utilizaron tres estándares disponibles comercialmente (óxido de cariofileno, khellin y alfa-santonina) para evaluar la aplicabilidad del sistema puriFlash-CMS como herramienta para la purificación rápida de compuestos lipofílicos a partir de extractos de plantas crudos.

Los cuatro cromatogramas muestran el perfil de la mezcla a escala preparativa con gradientes rápidos en dos tamaños de columna con una buena superposición de las señales UV y MS.

Todos los parámetros se optimizaron cuidadosamente tanto para la separación como para la detección. Se tuvo especial cuidado para encontrar condiciones de ionización y división que proporcionarían una buena detección y

Purificación guiada por Flash-MS de un compuesto dado

Esquema de la dilución de la bomba de maquillaje posterior a la columna

Sistema puriFlash-CMS

Los solventes de la fase normal son altamente inflamables para la fuente APCI y deben evitarse debido al proceso de calentamiento.

La dilución poscolumna optimizada era obligatoria para tener una ionización eficiente y segura. La mezcla de disolventes cuando alcanzó el detector de EM estaba en> 99% de ACN o MeOH.

La detección por APCI-MS con condiciones de división optimizadas y elución posterior a la columna del disolvente apropiado resultó robusta y muy adecuada para este tipo de purificación.

Purificación puriFlash-CMS de fase normal del extracto de raíces de Angelica archangelica

HPLC-UV analítica

Escala analítica:

Escala preparativa:

Flash preparativo UV-ELSD-MS

Las raíces de Angelica archangelica son ricas en derivados cumarínicos. La detección de MS-ELSD además de la detección de UV permitió el monitoreo de metabolitos secundarios con cromóforos débiles o nulos y la selectividad de la MS fue de gran ayuda para una colección precisa de compuestos parcialmente coeluyentes.

Conclusión

La purificación instantánea en fase normal representa una estrategia eficaz para un aislamiento racional de biomarcadores lipófilos específicos o compuestos bioactivos en función de los resultados del perfil de metabolitos. El fraccionamiento activado por MS y el monitoreo ELSD, además de la detección UV estándar, es una herramienta poderosa para una recolección precisa y para estimar la cantidad de compuestos separados. MS es particularmente útil para la recopilación específica de cualquier m / z en caso de coelución que a menudo ocurre en extractos crudos utilizando metodologías cromatográficas de alta carga y baja capacidad de pico.

Este enfoque rápido y racional se puede utilizar ampliamente para purificaciones de un solo paso y aislamiento de mezclas sintéticas y naturales. También es compatible para la detección de compuestos apolares que carecen de cromóforos, lo cual es muy común en la investigación de productos naturales. La separación realizada a escala preparativa permite purificar decenas a cientos de mg de compuestos para una mayor identificación estructural y evaluación de sus bioactividades.

Referencias

david righi1, Antonio Azzollini1, Emerson Ferreira Queiroz1, Jean-Luc Wolfender1
Facultad de ciencias farmacéuticas, Universidad de Ginebra, Universidad de Lausana, 30 Quai Ernest-Ansermet, 1211 Ginebra 4, Suiza
[1] Davy Guillarme, Dao TT Nguyen, Serge Rudaz, Jean-Luc Veuthey, Eur. J. Pharma. Biofarma. 2008, 68, 430

Publicado el

Purificación de péptidos: acoplamiento Flash-MS utilizando puriFlash 5.250P y expresión CMS

Para adaptarse, Interchim instaló un laboratorio para poder realizar demostraciones en línea. Estas demostraciones se pueden articular en torno a purificaciones de productos "estándar" para demostrar el potencial de nuestros instrumentos. Este ejemplo demuestra las capacidades de un sistema flash-ms con Interchim puriFlash 5.250 y Advion exprensaion Espectrómetro de masas compacto (CMS) para la purificación de un péptido.

Instalación

Para la purificación de un péptido resultante de la síntesis química, utilizamos el puriFlash 5.250P. Para monitorear esta purificación, usamos un detector UV y Advion exprensaion CMS.

La detección de péptidos por espectrometría de masas se realiza con una fuente ESI, que es ideal para la detección de moléculas grandes como péptidos. La interfaz MS "desvía" una pequeña cantidad de producto para su detección.

Análisis de inyección de flujo (FIA)

Inyección directa de muestra cruda en el exprensaion CMS.

Aquí están los espectros de masas resultantes:

Observamos un pico en m / z 643, que corresponde a la molécula de interesada cargada 3 veces (M + 3H)3+, así como un pico en m / z 964.3, que corresponde a la molécula de interés cargada 2 veces (M + 2H)2+.

Condiciones de HPLC


Aquí están los resultados:

Transposición y purificación

Se utilizó una columna de péptidos con una columna preparativa: PFB5C18T-150/212.

En primer lugar, el método de HPLC analítica se traspuso a un método de HPLC preparativa.

Luego, se incrementó la concentración de la muestra inyectada para poder purificar la cantidad máxima de producto en una sola corrida.

Gracias al sistema puriFlash 5.250P junto con el exprensaion CMS, el producto de interés se purificó y recogió en base a su masa.

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Mejor química de la purificación flash inteligente

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Todos hemos estado allí: desea hacer una simple purificación Flash.

Fácil, ¿verdad?

Luego comienza a preparar su mezcla de reacción, piensa en monitorear la reacción, confirmar el producto, desarrollar el método Flash ...

Esta publicación destaca algunas formas de hacer que la purificación Flash sea más fácil que nunca. Siga leyendo para obtener consejos sobre el monitoreo de la reacción, la purificación y la identificación de la fracción.

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Pre-Flash Run: Realizando (y monitoreando) Su reacción
Al comenzar, se enfrenta a varias decisiones que tomar, decisiones que pueden convertir el simple proceso de purificación en una aventura de medio día en la preparación de muestras y el desplazamiento por las redes sociales mientras espera los resultados de LC / MS.

La primera decisión que debe tomar es cómo puede hacer su compuesto de manera rápida y fácil y llevarlo al sistema Flash. ¡Pronto!

Consejo # 1: Reduce los tiempos de espera.
Si piensa, "¡LC / MS es lo mejor!" es posible que desee reconsiderarlo. La monitorización de reacciones se puede realizar de forma mucho más rápida y sencilla utilizando tecnologías alternativas como TLC. Considere lo que realmente necesita: una respuesta rápida a "¿Hice mi compuesto?" Busque encontrar esa respuesta de la manera más fácil posible, utilizando la tecnología más sencilla (incluso básica) que tenga a mano en su laboratorio.

Consejo # 2: Reduzca la preparación de su muestra.
Si elige usar la ruta TLC sobre LC / MS (¡Bravo!) Para monitorear la reacción, aún tendrá algunos pasos entre usted y la ejecución de Flash. Es decir, la molestia de raspar manchas, prepararlas en un solvente para inyección directa en el espectrómetro de masas. Puede ser una oportunidad para explorar tecnologías adicionales disponibles en el mercado, como un lector de placas TLC. Esta nueva tecnología le brinda un análisis de botón de las placas TLC. Sin raspar. Sin preparación de muestra. Sin limpieza. Solo resultados en segundos.

Imagínese: su reacción se completa y su compuesto de interés se identifica con solo presionar un botón.

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Durante la ejecución de Flash: use las herramientas disponibles
Lo bueno es que (generalmente) la tecnología está de nuestro lado. Gracias a la inteligencia artificial, las ejecuciones automáticas y la mentalidad de "configúralo y olvídalo" de varios procesos químicos tediosos, afortunadamente hemos evolucionado hasta un momento en el que muchos expertos líderes en la industria han hecho el trabajo por ti.

Consejo # 3: Simplifique el desarrollo del método Flash.
Varias preguntas surgen durante el desarrollo del método en Flash que, a menos que sea un experto, es posible que no lo sepa definitivamente. ¿Cuáles son sus valores de Rf? ¿Qué columna debes elegir? Si su sistema Flash ofrece la capacidad de simplificar el desarrollo de métodos con detalles sugeridos, es un buen punto de partida y puede ayudar a que su purificación de rutina funcione sin problemas.

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Después de la ejecución de Flash: identificación de fracciones
Has superado tu purificación y te sientes seguro del trabajo que has realizado hasta ahora. Es de esperar que no dedicó ningún tiempo a monitorear su reacción y preparar su método, y se siente seguro de que dejó que el sistema Flash lo ayude con el desarrollo del método. ¿Pero ahora que? ¿Ha llegado el momento de desempolvar el antiguo LC / MS?

Consejo # 4: Simplifique la identificación de la fracción
No hay una forma única de identificar un compuesto. Como aprendimos antes, la TLC es una alternativa ideal a la LC / MS para el monitoreo de reacciones. Ahora, lo vemos desde un ángulo diferente: ¿cómo identificar rápidamente las fracciones en sus tubos sin perder su valioso tiempo?

Herramientas como la sonda de líquidos y sólidos Advion ASAP son ideales para esto. La sonda simple se sumerge en uno de los tubos y luego se inserta en la fuente de iones APCI de la especificación de masas. Esto permite un muestreo sin preparación y otra forma de omitir la LC / MS.

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¿Tienes algún consejo (o dolor de cabeza) para agregar a esta lista? Envíanos un correo electrónico, info@advion.com y hazte conocer! Nos complace conectarlo con un experto en Flash de nuestro equipo.

¿Está interesado en un sistema de flujo de trabajo optimizado de TLC a Flash a ASAP? Advion x Interchim ofrece actualmente un sistema Flash gratuito con la compra de un espectrómetro de masas. Haga clic aquí para obtener más información sobre las últimas ofertas especiales.

Video más tu estilo? Vea un flujo de trabajo completo de Flash, de reacción a fracción en nuestro último clip: