Extracción y purificación de 3 curcuminoides a partir de polvo de cúrcuma
Instrumentación:
Destello: puriFlash® XS520
Cuidado y cariño: Plate Express™ Lector de placas TLC
Espec. de masa: exprensaion® Espectrómetro de masas compacto
Muestreo: Lo antes posible® Sonda de análisis directo
Introducción
Los curcuminoides son compuestos de polifenoles naturales derivados de la raíz de cúrcuma (Curcuma longa). Se informa que tienen actividades antioxidantes.1. La curcumina es el principal curcuminoide que se encuentra en la cúrcuma. Se usa comúnmente como ingrediente en suplementos dietéticos y cosméticos, saborizante en platos culinarios y colorante alimentario de color amarillo anaranjado.
En esta nota de aplicación, un método para separar y purificar 3 curcuminoides del polvo de cúrcuma mediante cromatografía flash con Advion Interchim Scientific puriFlash® XS520 Plus, TLC con espectrometría de masas con Plate Express™ TLC Plate Reader y exprensaion® Se demuestra CMS. Las fracciones se identificaron utilizando la sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP®).
Extracción de curcuminoides
El polvo de cúrcuma se pesó (57.3 g) y se transfirió a una botella de vidrio de boca ancha. Se añadió etanol (250 ml, graduación 200) a la botella y la mezcla se agitó durante 18 horas mientras se tapaba con papel aluminio. Los compuestos de interés son sensibles a la luz. A continuación, la suspensión se filtró y el filtrado se concentró a sequedad para formar un aceite de color ámbar (6.4 g).
Figura 1: Estructuras de curcuminoides.
Figura 2: Polvo de cúrcuma comprado en la tienda (izquierda) y aceite de extracto crudo (derecha).
Análisis TLC/MS
El Advion Interchim Scientific Plate Express™ combinado con el exprensaion® CMS permite una fácil identificación de puntos en placas de TLC sin necesidad de purificación o preparación de muestras (Figura 3).
El análisis TLC inicial mostró 4 puntos (diclorometano:metanol, 97:3). Los tres puntos inferiores eran muy fluorescentes, como se esperaba para los curcuminoides de interés. Los puntos de TLC se analizaron mediante ionización APCI en modo de iones negativos. Los 3 puntos inferiores se caracterizaron por espectrometría de masas.
Figura 3: Advion Interchim Scientific exprensaion® Lector de placas TLC CMS y Plate Express™ (izquierda) y primer plano del cabezal de extracción de placas TLC (derecha).
Figura 4: Placa TLC revelada visualizada a 365 nm. Espectros de masas resultantes de curcumina (arriba), demetoxicurcumina (centro) y bisdemetoxicurcumina (abajo).
Purificación instantánea
Se usó un método isocrático ya que la separación que se muestra en TLC era óptima tal cual. El material bruto se purificó en una columna de gel de sílice esférica de 25 g y 15 μm (PF-15SIHC-F0025). Se cargó en seco un peso bruto de 64 mg en 500 mg de gel de sílice y se cargó en un cartucho de carga seca de 4 g (PF-DLE-F0004).
Figura 5: Cromatograma flash resultante de la placa TLC desarrollada.
Identificación de fracciones por ASAP®/CMS
La exprensaion® CMS con el ASAP® La sonda de análisis directo permite una fácil identificación de compuestos sin necesidad de LC/MS o preparación de muestras.
Las fracciones puras (1.1, 1.3 y 1.5) se analizaron utilizando el ASAP® sonda con ionización APCI y CMS de polaridad positiva. Sin embargo, los curcuminoides se ionizan bien tanto en polaridad positiva como negativa de APCI (M+H)+ los iones mostraron menos fragmentación. Las masas detectadas son consistentes con el teórico [M+H]+ valores m/z.
Figura 6: Advion Interchim Scientific lo antes posible® La sonda de análisis directo se inserta directamente en la fuente de iones habilitada para APCI del exprensaion® CMS.
Figura 7: Espectros de masas de fracciones.
Las fracciones purificadas se concentraron a sequedad para dar los sólidos I (14.1 mg), II (5.6 mg) y III (6.7 mg) respectivamente, que representan curcumina (I), demetoxicurcumina (II) y bisdemetoxicurcumina (III) al 53.4 %. 21.2%, y 25.3% del perfil curcuminoide aislado. Estos resultados son consistentes con los valores reportados en la literatura.2.
Confirmación de la pureza del compuesto por RP-HPLC
Figura 8: Escaneo UV de la mezcla de fracción purificada.
La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) permite una confirmación separada de la pureza del compuesto después de la cromatografía flash. Se combinó una mezcla igual de los tres compuestos y se ejecutó en un Phenomenex Kinetex® 5 μColumna de bifenilo m 100 Å 50 x 2.1 mm usando ACN isocrático:agua (v:v, 55:45) con ácido fórmico al 0.2%. Como era de esperar, el orden de elución de los tres curcuminoides cambió de orden ahora eluyendo III, II e I (Figura 8). Después de desarrollar este método, se inyectó la respectiva fracción única recolectada y se analizó la pureza y se confirmó nuevamente mediante análisis de MS.
Figura 9: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.1.
Figura 10: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.3.
Figura 11: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.5.
Conclusión
Con una combinación de cromatografía TLC, cromatografía flash y soporte de espectrometría de masas en varias etapas del proceso (identificación de placa TLC, confirmación de fracción y análisis de pureza secundario), podemos purificar curcuminoides a partir de polvo de cúrcuma a niveles de pureza confirmados de >95 %.
Referencias:
1Jayaprakasha et al. Actividades antioxidantes de la curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina. Food Chemistry, volumen 98, número 4, 2006, páginas 720-724. ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2Praveen et al. Enfoque sencillo de RMN para perfilar los curcuminoides presentes en la cúrcuma, Food Chemistry, volumen 341, parte 2, 2021, 128646, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.128646.