Colección de fracciones dirigidas a la masa de productos naturales: ejemplos de extracto de cúrcuma y té verde
Flash: PuriFlash® 5.250
Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: lo antes posible® sonda
Introducción
La cromatografía ultrarrápida ha utilizado tradicionalmente la absorción UV como método principal de detección de compuestos durante un proceso de purificación. Mientras que la absorción UV es ampliamente aplicable a muchas clases de compuestos, tiene una especificidad limitada para los compuestos individuales en una mezcla y pasa por alto las clases de compuestos que no llevan cromóforos.
La recolección de fracciones dirigida por masa brinda a los usuarios la capacidad de recolectar fracciones basadas en la detección de espectrometría de masas (MS), que se basa en iones específicos de compuestos individuales y proporciona información molecular específica. Esto permite la simplificación del proceso de purificación general y una mayor confianza en la identidad de cada compuesto aislado.
Aquí describimos métodos para aislar productos naturales a partir de té verde y polvo de cúrcuma mediante la recolección de fracciones dirigidas a la masa durante la cromatografía flash y la CL preparativa. Con fines de demostración, los compuestos aislados se confirmaron adicionalmente mediante la sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP®) MS o HPLC-MS.
Introducción a los curcuminoides
La curcumina es el principal curcuminoide que se encuentra en la raíz de la cúrcuma (Curcuma longa). Se usa comúnmente como ingrediente en suplementos dietéticos y cosméticos, saborizante en platos culinarios y colorante alimentario de color amarillo anaranjado. Se ha informado que los curcuminoides tienen actividades antioxidantes y antiinflamatorias.
El polvo de cúrcuma comprado en la tienda (57.3 g) se extrajo en etanol, luego se filtró a través de papel de filtro y se concentró. Esto produjo un aceite de extracto crudo de 6.4 g que contenía los tres curcuminoides de interés (compare también el análisis de TLC en la Figura 4).
Figura 1 y XNUMX: Estructuras de los curcuminoides de interés.
Figura 2 y XNUMX: Polvo de cúrcuma comprado en la tienda.
Figura 3 y XNUMX: Aceite de extracto crudo de polvo de cúrcuma.
Figura 4 y XNUMX: Análisis TLC a 365 nm de extracto de cúrcuma (97:3 DCM:MeOH) y el cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección UV.
Desarrollo de métodos
El extracto de cúrcuma se analizó primero en una placa TLC y luego el método se transfirió al puriFlash® Sistema 5.250 que utiliza detección UV en dos longitudes de onda. Se detectaron cuatro compuestos a 254 nm con tres supuestos curcuminoides detectados a 427 nm, sin embargo, no hay especificidad para los compuestos individuales en la detección UV.
Se utilizó un método isocrático (97:3 diclorometano:metanol) ya que la separación mostrada en TLC fue óptima. El material bruto se purificó en una columna de gel de sílice esférica de 12 g y 15 μm (PF-15SIHC-F0012). Se cargó en seco un peso bruto de 32 mg en 250 mg de gel de sílice y se cargó en un cartucho de carga seca de 4 g (PF-DLE-F0004). Las fracciones se recolectaron usando los canales XIC para cada compuesto de interés.
Figura 5 y XNUMX: Captura de pantalla del método de cromatografía flash ejecutado con parámetros.
Los ajustes del espectrómetro de masas se controlan a través de InterSoft®Software X en el puriFlash® sistema. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente APCI y funcionó con el modo de adquisición de ionización negativa.
Figura 6 y XNUMX: Captura de pantalla de los parámetros del espectrómetro de masas para la ejecución de la cromatografía.
Experimento
Colección de fracciones dirigidas a masas
El cromatograma de iones extraídos (XIC) creado al graficar la intensidad de la señal observada en un valor elegido de masa a carga. Esto permite una señal de bajo ruido de los compuestos de interés. Aquí los canales XIC están configurados para detectar los tres curcuminoides de interés.
Figura 7 y XNUMX: Análisis TLC del extracto de cúrcuma (97:3 DCM:MeOH) y cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección MS XIC.
Figura 8 y XNUMX: Los espectros de masas para cada pico proporcionados por el puriFlash® intersoft®programa X.
Lo antes posible® Confirmación de fracciones MS
Las fracciones puras (1.1, 1.2 y combinadas 1.3 y 1.4) se analizaron adicionalmente usando ASAP® EM de polaridad negativa. Las masas detectadas son consistentes con los valores teóricos [MH]-m/z.
Figura 9 y XNUMX: Los espectros de masas de los compuestos aislados confirmando su identidad y pureza.
Introducción, Catequinas del té verde
El té verde seco generalmente consta de 10 a 30 % de polifenoles en base al peso seco, siendo las catequinas los principales polifenoles del té, incluidos: (-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), (-) -epicatequina-3-galato (ECG) y (-)-galocatequina galato (GCG). EGCG es la catequina más abundante y biológicamente activa, la separación y purificación de las catequinas del extracto de té crudo puede aumentar considerablemente su disponibilidad y valor en el mercado.
Las hojas secas de té verde se extrajeron en agua caliente, luego se repartieron con acetato de etilo, se filtraron a través de papel de filtro y se evaporaron para dar un extracto crudo. Luego, el extracto seco se disolvió en 7.5 ml de agua y se filtró con un filtro de 0.2 μm antes de continuar con el procesamiento.
Figura 10 y XNUMX: Hojas de té verde en remojo.
Figura 11 y XNUMX: Principales catequinas en el té verde.
Desarrollo de métodos
Con el análisis HPLC-UV/MS, se detectan EGC, EGCG, GCG, EC y ECG en el extracto de té (Figura 12).
Disolvente A: Agua
Disolvente B: Metanol
ultravioleta: 275nm
MS: escaneo completo de 150-900
Columna: US15C18HP-250/046
Figura 12 y XNUMX: Se utilizó el cromatograma HPLC-UV del extracto de té verde, datos de MS y un estándar para EGCG para la confirmación del compuesto (datos no mostrados).
Los ajustes del espectrómetro de masas se controlan a través de InterSoft®Software X en el puriFlash® sistema. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente ESI y funcionó con el modo de adquisición de ionización negativa.
Figura 13 y XNUMX: Captura de pantalla de los parámetros del espectrómetro de masas para la ejecución de la cromatografía.
Colección de fracciones dirigidas a masas
Aquí los canales XIC están configurados para detectar las 4 catequinas de interés. EGCG y CGC son isómeros y por lo tanto comparten la misma masa.
Figura 14 y XNUMX: Cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección MS XIC.
Figura 15 y XNUMX: Los espectros de masas para cada pico proporcionados por InterSoft®programa X.
Conclusión
• Con el aislamiento de productos naturales, uno de los mayores desafíos es la identificación de compuestos de interés en mezclas de extractos complejos.
• Usando MS y cromatografía en tándem, podemos separar e identificar compuestos en una mezcla compleja con un alto grado de pureza y precisión sin necesidad de una mayor identificación de las fracciones recolectadas.
• Las fracciones recolectadas se pueden caracterizar directamente a través de los datos de MS proporcionados por InterSoft®Software X en el puriFlash® .
• El puriFlash® 5.250 y exprensaion® CMS forma un poderoso dúo en la purificación e identificación de productos naturales como las catequinas que se encuentran en el té verde y los curcuminoides que se encuentran en la cúrcuma.