Purificación de péptidos bioactivos a partir de mezclas complejas con puriFlash® 5.250 PrepLC y exprensaion® Detector CMS

Instrumentación
Espec. de masa: exprensaion^® CMS
Destello: puriFlash^® 5.250 preparación LC
HPLC: AVANT^®

Autor
Changtong Hao
Advion Interchim Científico

Introducción
En los últimos años, las empresas biofarmacéuticas han adoptado cada vez más los fármacos basados ​​en péptidos/proteínas debido a su mayor especificidad y selectividad en comparación con los fármacos tradicionales de moléculas pequeñas. Sin embargo, la purificación de péptidos/proteínas durante el proceso de descubrimiento de fármacos es crucial para garantizar la seguridad y eficacia del producto final. Alcanzar los niveles de pureza más altos posibles para los compuestos objetivo bioactivos es esencial para minimizar el riesgo de toxicidad y cumplir con los estándares regulatorios.^{[ 1,2 ]}

El aislado de proteína de suero, un subproducto de la producción de queso, contiene varios glucomacropéptidos y dos péptidos bioactivos significativos, el macropéptido A de caseína (CMPa) con un peso molecular (MW) de 6757 Da y el macropéptido B de caseína (CMPb) con un PM de 6787 Da . Extracción y purificación de componentes individuales, como la caseína.
macropéptido, es esencial para investigar su bioactividad.^{[ 3 ]}

En esta nota de aplicación, usamos aislado de proteína de suero de leche y dos macropéptidos de caseína como ejemplo para demostrar el aislamiento y la purificación de componentes bioactivos con un sistema compuesto por un puriFlash^® 5.250 prepLC acoplado en línea a un exprensaion^® detector de CMS. Esta combinación ofrece una mayor selectividad y sensibilidad en comparación con los detectores tradicionales como UV o ELSD, que pueden no responder de manera efectiva a los péptidos y proteínas objetivo bioactivos.

Advion Interchim Científico
puriFlash^® 5.250

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exprensaion^® CMS

Método
Preparación del aislado de proteína de suero
• El procedimiento de aislamiento de macropéptidos de caseína utilizado en esta aplicación se basa en el trabajo de Tadao Saito.^{[ 4 ]} con algunas modificaciones.
• Se combinó una muestra de 50 g de aislado de proteína de suero de leche comprado en una tienda local con 500 ml de una mezcla de disolventes de 70 % de agua y 30 % de metanol (v/v). La mezcla se sonicó a 70°C durante 90 minutos y luego se filtró a presión reducida.
• El filtrado resultante se concentró a un volumen de 300 mL mediante la eliminación de metanol utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida a 40 °C. Luego se almacenó a 4°C durante una hora. Posteriormente, se añadió a la solución un volumen igual de etanol frío y la mezcla se agitó durante 5 minutos antes de almacenarla a 4 °C durante 4 horas más.
• La mezcla se filtró a presión reducida utilizando un filtro de 0.5 μm. Luego, el filtrado final se concentró hasta un volumen de 50 ml utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida.
• Una alícuota de 100 μL del extracto concentrado se mezcló con 900 μL de desionizado (DI)
agua para análisis HPLC/MS analíticos.
• El filtrado restante se usó para la purificación de péptidos usando el puriFlash^® 5.250 Sistema PrepLC junto con un exprensaion^® detector de CMS.

Tabla 1: Configuración del método HPLC/MS analítico

Configuración del método HPLC/MS analítico
El extracto líquido del aislado de proteína de suero se analizó por primera vez con un AVANT^® Se desarrolló un sistema HPLC/CMS y un método de separación por cromatografía para la columna de 4.6 mm utilizada (Tabla 1).

La figura 1a muestra el cromatograma HPLC/MS del extracto líquido. Los espectros de MS promediados desde el pico a los 6.44 min indican que el compuesto es un péptido de carga múltiple con al menos cinco masas en m / z 755.2, 849.4, 970.6, 1132.1 y 1358.6 (Figura 1b) formando un perfil de carga.

A través de la deconvolución de carga del software, se determinó que la masa no cargada del péptido era 6787.4 Da, lo que indica macropéptido B de caseína (CMPb, masa teórica de 6787 Da) (Figura 1c).

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AVANT^® (U) HPLC

Figura 1: (a) Cromatograma de HPLC/MS del extracto líquido del aislado de proteína de suero, (b) Los espectros de MS promediados del pico a TA 6.44 min, (c) La masa desconvolucionada y sin carga del pico de elución del péptido a TA 6.44 min.

Figura 2: (a) Cromatograma de HPLC/MS del extracto líquido del aislado de proteína de suero, (b) Los espectros de MS promediados del pico a TA 11.02 min, (c) La masa desconvolucionada y sin carga del péptido que eluye a TA 11.02 min.

Los espectros de MS promediados obtenidos del pico que eluyó a los 11.02 min sugieren que el compuesto también es un péptido de carga múltiple con masas en m/z 751.5, 845.4, 966.1, 1126.8 y 1352.1 (Figura 2b) que forman su perfil de carga.

De manera similar, la desconvolución de carga determina que la masa sin carga de este péptido es de 6755.3 Da, lo que indica la variante A del macropéptido de caseína, CMPa con una masa teórica de 6755 Da (Figura 2c).

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puriFlash^® 5.250, divisor MS y exprensaion^® CMS

Cromatografía PrepLC/MS
En un paso siguiente, el método de separación analítica se transpuso a la escala de preparación más grande de una columna de 4.6 mm de DI a una columna de 30 mm de DI y se optimizó aún más para la purificación de los dos CMP (caseína glico-macropéptidos) en el puriFlash^® 5.250 Sistema PrepLC/Flash acoplado online al exprensaion^® detector de CMS.

El cromatograma PrepLC-UV/MS del aislado de proteína de suero se muestra en la Figura 3 y los parámetros se muestran en la Tabla 2.

La recolección de fracciones se activó en función de la señal de MS, elegida por su mayor selectividad y sensibilidad. Se usó XIC de 970-971 Da para detectar CMPb y XIC de 965-966 Da para CMPa.

El solvente orgánico en la combinación de las fracciones 11-17 y la fracción 18-22 se eliminó usando un evaporador rotatorio bajo presión negativa, y el resto acuoso
La solución se secó usando un liofilizador LABCONCO Freezone 2.5L (-50 C), lo que resultó en una colección seca de 10 mg cada uno, que luego se disolvió en 10 ml de agua desionizada para el posterior análisis HPLC/UV/MS. Los resultados del análisis de pureza se muestran en las figuras 4 y 6.

Tabla 2: Configuración del método PrepLC/MS

Figura 3: El cromatograma PrepLC-UV/MS de dos aislados de proteína de suero

Resultados

Análisis de pureza de CMPb
El análisis de pureza de CMPb en las fracciones combinadas 11 a 17 se muestra en la Figura 4. El análisis de MS muestra que se detectaron cuatro iones principales con m/z en 970.8, 1132.3, 1358.6 y 1968.2 (Figura 4b).

Con los espectros de masas promediados de la Figura 4b, se determinó que la masa sin carga del pico a los 5.94 min era 6788.4 (CMPb, Figura 4c). Sin embargo, el análisis de MS también puede detectar cuatro componentes menores en 6758.3, 6773.5, 6804.8 y 6868.4 Da.

La pureza UV obtenida de CMPb es del 86.7 % (Figura 4d), pero, según los datos de MS adicionales, la pureza del compuesto es en realidad menor que eso (80 % estimado).

Se midió que el CMPa en las fracciones agrupadas 18 a 22 era del 94.7 % (figura 5a) según el análisis UV de la serie analítica.

El análisis de masa sin carga desconvolucionada muestra la masa dominante esperada de 6756.2 de CMPa (figura 5b) y un componente menor en 6774.6, una forma oxidada de CMPa.

De nuevo, este ejemplo muestra el valor de la detección por MS de compuestos bioactivos como péptidos y proteínas, y la mejor especificidad de la detección por MS en comparación con la UV.

Figura 4: (a) El cromatograma HPLC-MS de fracciones agrupadas de 11-17, (b) Espectros de MS promediados del pico eluyendo a TA 5.94 min, (c) la masa sin carga de (b), (d) El cromatograma HPLCUV de fracciones agrupadas del 11 al 17.

Figura 5: (a) El cromatograma HPLC-UV de fracciones agrupadas de 18-22. (b) masa desconvolucionada sin carga de CMPa.

La pureza total final se estima en aprox. 90%, un valor excelente para una molécula bioactiva en el descubrimiento de fármacos.

Se puede lograr una mayor mejora en la pureza con fracciones selectivas, a costa del rendimiento. Por ejemplo, el análisis HPLC-UV/MS de la fracción 20 de CMPa (Figura 6a) muestra una pureza UV del 99.0 % (Figura 6d) y ningún subproducto oxidado en el análisis MS.

Figura 6: (a) el cromatograma HPLC-MS de la fracción 20, (b) espectros de MS promediados del pico a TA 5.71 min, (c) masa desconvolucionada sin carga de CMPa (d) el cromatograma HPLCUV de las fracciones 20.

Conclusión
El puriFlash^® 5.250 Sistema PrepLC/Flash, acoplado en línea con un exprensaion^® El detector CMS logra un rendimiento sobresaliente, facilitando la purificación selectiva de macropéptidos bioactivos de una matriz compleja con un alto nivel de confianza. En comparación con los detectores UV o ELSD, el espectrómetro de masas ofrece una selectividad y sensibilidad superiores.

Una aplicación ilustrativa de este enfoque muestra el aislamiento de macropéptidos de glicol de caseína, lo que da como resultado un rango de pureza del 80 % (CMPb) al 90 % (CMPa) a través de fracciones combinadas con alto rendimiento. Se puede lograr una pureza aún mayor de hasta el 99.0 % con fracciones selectivas.

 

Referencias

^{[ 1 ]}Gräslund, S., et al. (2008). Producción y purificación de proteínas. Métodos de la naturaleza, 5(2), 135-146.
^{[ 2 ]}Procesamiento biofarmacéutico: desarrollo, diseño e implementación de procesos de fabricación.
^{[ 3 ]}Lin T., et al. (2021) Bioactivos en la leche bovina: química, tecnología y aplicaciones Nutrition Reviews v79(S2):48–69
^{[ 4 ]}Saito T. y otros. (1991) Un nuevo método de aislamiento de caseinoglicopéptido del suero de queso dulce. J. Ciencias de la leche. 74, 2831-2837