Mapeo rápido y automatizado de péptidos para terapias proteicas
Instrumentación
Espec. de masas: Trampa orbital Thermo Scientific® Instrumentos
Muestreo: TriVersa NanoMate LESA®
Escritores
Josh Coon, doctor
Universidad de Wisconsin-Madison y CeleramAb™
Daniel Eikel, doctor
Advion Interchim Científico®
Introducción
A diferencia de los fármacos de moléculas pequeñas, los productos biológicos (o terapias proteicas), como los anticuerpos, pueden ser fármacos muy potentes porque actúan sobre vías biológicas con mucha mayor especificidad, lo que permite el tratamiento de enfermedades complejas como el cáncer, trastornos autoinmunes o afecciones metabólicas, reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios no deseados. La caracterización precisa de estos productos biológicos, incluyendo su estructura, modificaciones postraduccionales, estabilidad y actividad, es esencial para garantizar su seguridad, eficacia y consistencia en todos los lotes de producción. Incluso pequeños cambios en el plegamiento de proteínas, causados, por ejemplo, por una modificación química en un aminoácido, pueden disminuir la función de una terapia proteica o, peor aún, desencadenar respuestas inmunitarias no deseadas. Por lo tanto, métodos analíticos rigurosos guían el diseño óptimo, la viabilidad de fabricación y el control de calidad. Una caracterización precisa también respalda la aprobación regulatoria y ayuda a identificar biomarcadores o mecanismos que mejoran el rendimiento terapéutico y los resultados del paciente.
Aquí describimos un enfoque de caracterización de proteínas/anticuerpos basado en la digestión enzimática estandarizada en placas de 96 pocillos, la inyección rápida de los péptidos generados en espectrómetros de masas de alta resolución y el posterior análisis automatizado de datos para la caracterización completa de la secuencia de proteínas de hasta 1000 mAb al día (Figura 1).
Advion Interchim Científico® Sistemas
TriVersa NanoMate LESA® con chip ESI® Tecnología:
Figura 1 y XNUMX:Combinando la tecnología de CeleramAb™ y Advion Interchim Scientific® Crear un enfoque de análisis terapéutico de proteínas basado en la digestión enzimática de proteínas, MS de infusión directa, MS/MS y procesamiento automatizado de datos para lograr un rendimiento de 1000 mAbs al día.
Conceptos y experimentos
Las proteínas terapéuticas pueden degradarse debido a diversos factores, como el tiempo, los cambios de pH y la exposición a la luz o al calor, lo que provoca cambios en los aminoácidos a lo largo de la secuencia peptídica del fármaco biológico. Cambios como la desamidación, la oxidación o la pirolización pueden causar cambios en el plegamiento y la función. La Figura 2 muestra los cambios típicos observados en un anticuerpo. Otros cambios en la glicosilación, la fosforilación o el estado de oxidación Cys-Cys también afectan el plegamiento y la función de un fármaco biológico. Por lo tanto, todas estas modificaciones deben investigarse, caracterizarse y, en última instancia, mantenerse y controlarse de forma rutinaria para generar un nuevo fármaco valioso.
Figura 2 y XNUMXLas terapias proteicas pueden degradarse en función de diversos factores, como el tiempo, los cambios de pH, la exposición a la luz o al calor, lo que provoca cambios en los aminoácidos a lo largo de la secuencia peptídica del fármaco biológico, cambios como la desamidación, la oxidación o la pirolización.
Una forma típica de analizar secuencias de proteínas es la digestión enzimática de la proteína hasta sus bloques peptídicos y su respectivo análisis mediante LC-MS/MS. La cromatografía separa los péptidos en el tiempo, mientras que la espectrometría de masas permite el análisis espectral de masas de los péptidos, generando iones de fragmentación y, por lo tanto, información de la secuencia. Históricamente, estas ejecuciones de LC-MS/MS llevaban mucho tiempo, con tiempos de ejecución típicos de entre 30 y 120 minutos, y requerían un extenso análisis de datos fuera de línea para mostrar la cobertura completa de la secuencia y la caracterización de la proteína. Ambos factores limitaban considerablemente el número de muestras que se podían procesar en un día e indirectamente el número de experimentos con proteínas terapéuticas.
En lugar de la LC-MS/MS, que requiere mucho tiempo, presentamos un enfoque que utiliza la espectrometría de masas por infusión directa (DI) de forma automatizada. Este enfoque se ha vuelto viable gracias a que los espectrómetros de masas modernos ofrecen tiempos de ciclo mucho mayores para realizar experimentos de MSn y permiten una alta precisión y resolución de masas para la asignación inequívoca de secuencias de péptidos y modificaciones directamente a partir de los datos de MS. El desarrollo de una fuente de iones automatizada basada en la tecnología ESI chip® proporciona una ionización nano ESI consistente y altamente eficiente utilizando una ruta de muestra compuesta por una muestra, una punta y un nuevo emisor nESI para cada muestra consecutiva, eliminando por completo la contaminación cruzada. Como se muestra en la Figura 3, este enfoque utiliza reactivos estandarizados en un formato de 96 pocillos para la digestión enzimática de anticuerpos siguiendo protocolos reproducibles, y el sistema robótico automatizado de infusión de muestras NanoMate Triversa para ionizar los péptidos generados y analizarlos en el espectrómetro de masas, generando espectros de masas con gran cantidad de información de cada muestra en tan solo un minuto. El procesamiento de datos también está automatizado con software personalizado para abordar ambos cuellos de botella descritos anteriormente, lo que da como resultado un rendimiento de hasta 1000 muestras al día.
Figura 3 y XNUMX:Esquema del flujo de trabajo de mapeo de péptidos basado en la digestión de anticuerpos estandarizados de la proteína terapéutica en placas de 96 pocillos, espectrometría de masas de alta resolución de infusión directa rápida y automatizada para generar datos de MS ricos en información (los datos se procesan automáticamente para un rendimiento de 1000 mAbs al día).
Configuración y métodos experimentales
La Figura 4 muestra un conjunto típico de experimentos con este método de inyección directa – MS/MS (DI-MS/MS). En este caso, se analizó por triplicado la estabilidad de dos muestras diferentes (anticuerpo X y un anticuerpo estándar del NIST) frente al calor y a cambios de pH.
Tras la digestión estándar, las muestras se inyectaron en el sistema de MS según lo descrito, y se muestran los datos de MS sin procesar. En poco más de una hora, se analizaron 42 muestras del experimento de estabilidad y los controles. En la línea de tiempo se pueden observar picos de intensidad de datos de MS para cada experimento de infusión de 1 minuto, seguidos de periodos sin datos (que reflejan el tiempo que tarda el robot en introducir la siguiente muestra en el sistema de MS). Esta hora es aproximadamente el mismo tiempo que se suele consumir para una sola muestra en un método tradicional de LC-MS.
El análisis de ejemplo del péptido DTLMISR ilustra el flujo de trabajo. La Figura 5 muestra los datos de MS de un aminoácido metionina oxidado en la secuencia peptídica DTLM(ox)ISR de un anticuerpo terapéutico. Un análisis típico por LC-MS requeriría de 30 a 120 minutos para separar el digesto proteico, seguido de una inspección manual de los datos. Sin embargo, el método basado en DI-MS/MS solo requiere un tiempo de ejecución de 1 minuto con ambos péptidos relacionados (estado nativo y oxidado) separados en fase gaseosa por su relación masa-carga y detectados mediante un algoritmo automatizado de desplazamiento de masa. Los cálculos del estado de oxidación se determinan mediante la intensidad iónica y se calculan hasta un 19.6 % de oxidación, lo cual concuerda perfectamente con el resultado de LC-MS; sin embargo, la información se obtiene en una fracción de tiempo.
Figura 4 y XNUMXEjemplo de una secuencia de muestra con 14 muestras procesadas por triplicado en poco más de una hora. Ambas proteínas (anticuerpo X y un mAb estándar del NIST) se expusieron y analizaron en diversas condiciones (pH y temperatura). Cada análisis representa datos de MS de infusión de 1 minuto, recopilados para su posterior procesamiento y análisis de identificación y modificación de péptidos.
Figura 5 y XNUMXEjemplo de análisis de datos de un aminoácido metionina oxidado en la secuencia peptídica DTLMISR de un anticuerpo terapéutico. Un análisis típico por LC-MS/MS requiere de 30 a 120 minutos para separar el digesto proteico, seguido de una inspección manual de los datos. Sin embargo, el método basado en infusión directa-MS/MS solo requiere un tiempo de ejecución de 1 minuto, con ambas secuencias peptídicas relacionadas separadas en fase gaseosa y detectadas mediante un algoritmo automatizado de desplazamiento de masa. El cálculo del estado de oxidación se determina mediante la intensidad iónica y se calcula hasta un 19.6 % de oxidación, lo cual concuerda perfectamente con el resultado de LC-MS/MS; sin embargo, la información se obtiene en una fracción de tiempo.
Conclusión
El Advion Interchim Científico® TriVersa NanoMate® La fuente de iones automatizada es la herramienta perfecta para facilitar flujos de trabajo de alto rendimiento en la caracterización de proteínas terapéuticas basadas en estrategias de mapeo de péptidos. En combinación con CeleramAb™ Con un kit de reactivos estandarizado, métodos de ejecución de espectrometría de masas y herramientas de software de análisis automatizado, podemos lograr un aumento del rendimiento de un factor de 100 en comparación con los enfoques LC-MS estándar, lo que da como resultado hasta 1000 mAb analizados en un día.