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Cartographie peptidique rapide et automatisée des protéines thérapeutiques

Fournisseurs d'instruments
Spécification de masseThermo Scientific Orbitrap® Instruments
Échantillonnage de produits: TriVersa NanoMate LESA®

Auteurs
Josh Coon, docteur en philosophie
Université du Wisconsin-Madison et CeleramAb™

Daniel Eikel, docteur en philosophie
Advion Interchim Scientifique®

Introduction

Contrairement aux médicaments à petites molécules, les produits biologiques (ou protéines thérapeutiques), tels que les anticorps, peuvent être des médicaments très puissants car ils ciblent les voies biologiques avec une spécificité bien plus élevée. Ceci permet de traiter des maladies complexes comme le cancer, les maladies auto-immunes ou les troubles métaboliques, tout en réduisant les effets secondaires indésirables. Une caractérisation précise de ces produits biologiques – notamment leur structure, leurs modifications post-traductionnelles, leur stabilité et leur activité – est essentielle pour garantir leur innocuité, leur efficacité et leur homogénéité entre les lots de production. Même de petites modifications du repliement des protéines, dues par exemple à la modification chimique d'un seul acide aminé, peuvent altérer la fonction d'une protéine thérapeutique, voire déclencher des réactions immunitaires indésirables. Des méthodes analytiques rigoureuses guident donc la conception optimale, la fabricabilité et le contrôle qualité. Une caractérisation précise facilite également l'obtention des autorisations réglementaires et contribue à l'identification de biomarqueurs ou de mécanismes susceptibles d'améliorer l'efficacité thérapeutique et le pronostic des patients.

Nous décrivons ici une approche de caractérisation des protéines/anticorps basée sur une digestion enzymatique standardisée dans des plaques à 96 puits, l'injection rapide des peptides générés dans des spectromètres de masse à haute résolution et l'analyse automatisée des données pour la caractérisation complète de la séquence protéique jusqu'à 1000 mAbs par jour (Figure 1).

Advion Interchim Scientifique® Systèmes

TriVersa NanoMate LESA® avec puce ESI® Technologie

Figure 1: En combinant la technologie de CeleramAb™ et Advion Interchim Scientific® créer une approche d'analyse thérapeutique des protéines basée sur la digestion enzymatique des protéines, l'infusion directe MS, MS/MS et le traitement automatisé des données pour atteindre un débit de 1000 mAbs par jour.

Concepts et expériences

Les protéines thérapeutiques peuvent se dégrader sous l'effet de divers facteurs tels que le temps, les variations de pH, l'exposition à la lumière ou à la chaleur, entraînant des modifications des acides aminés le long de la séquence peptidique du médicament biologique. Ces modifications, comme la désamidation, l'oxydation ou la pyrolyse, peuvent altérer le repliement et la fonction de la protéine. La figure 2 illustre les modifications typiques observées sur un anticorps. D'autres modifications de la glycosylation, de la phosphorylation ou de l'état d'oxydation des résidus Cys-Cys ont également un impact sur le repliement et la fonction du produit biologique. Toutes ces modifications doivent donc être étudiées, caractérisées et, en définitive, contrôlées et maintenues de façon systématique afin de garantir l'efficacité du nouveau médicament.

Figure 2Les protéines thérapeutiques peuvent se dégrader en fonction de divers facteurs tels que le temps, les variations de pH, l'exposition à la lumière ou à la chaleur, entraînant des modifications des acides aminés le long de la séquence peptidique du médicament biologique, des modifications telles que la désamidation, l'oxydation ou la pyrolyse.

Une méthode courante d'analyse des séquences protéiques consiste en la digestion enzymatique de la protéine en ses peptides constitutifs, suivie de leur analyse par LC-MS/MS. La chromatographie sépare les peptides au cours du temps, et la spectrométrie de masse permet l'analyse spectrale des peptides, générant des ions de fragmentation et donc des informations sur la séquence. Historiquement, ces analyses LC-MS/MS étaient longues (30 à 120 minutes en moyenne) et nécessitaient un traitement hors ligne approfondi des données pour obtenir une couverture complète de la séquence et une caractérisation précise de la protéine. Ces deux facteurs limitaient fortement le nombre d'échantillons pouvant être traités quotidiennement et, indirectement, le nombre d'expériences menées sur des protéines thérapeutiques.

Au lieu de la LC-MS/MS, une méthode chronophage, nous présentons une approche automatisée utilisant la spectrométrie de masse par infusion directe (DI). Cette approche est devenue viable grâce aux spectromètres de masse modernes, dont le temps de cycle est considérablement réduit pour les expériences MSn. Elle permet une haute précision et une haute résolution de masse, autorisant ainsi l'identification univoque des séquences peptidiques et de leurs modifications directement à partir des données MS. Le développement d'une source d'ions automatisée, basée sur la technologie ESI chip®, assure une nano-ionisation ESI homogène et très efficace. Chaque échantillon consécutif utilise un seul échantillon, une seule pointe et un nouvel émetteur nESI, éliminant ainsi toute contamination croisée. Comme illustré sur la figure 3, cette approche utilise des réactifs standardisés dans un format 96 puits pour la digestion enzymatique des anticorps, selon des protocoles reproductibles. Le système d'infusion robotisé NanoMate Triversa ionise les peptides générés et les analyse dans le spectromètre de masse, permettant ainsi d'obtenir en une minute seulement des spectres de masse riches en informations pour chaque échantillon. Le traitement des données est également automatisé grâce à un logiciel personnalisé permettant de remédier aux deux goulots d'étranglement décrits ci-dessus, ce qui permet un débit allant jusqu'à 1000 échantillons par jour.

Figure 3Schéma du flux de travail de cartographie peptidique basé sur la digestion standardisée par anticorps de la protéine thérapeutique dans des plaques à 96 puits, la spectrométrie de masse à haute résolution par infusion directe rapide et automatisée pour générer des données MS riches en informations (les données sont traitées automatiquement pour un débit de 1000 mAbs par jour).

Dispositif expérimental et méthodes

La figure 4 présente un ensemble typique d'expériences réalisées avec cette approche d'injection directe couplée à la spectrométrie de masse en tandem (DI-MS/MS). Deux échantillons différents (l'anticorps X et un anticorps standard NIST) ont été testés en triplicata afin d'évaluer leur stabilité sous l'effet de variations de température et de pH.

Après digestion standard, les échantillons ont été injectés dans le système de spectrométrie de masse (SM) comme décrit précédemment, et les données brutes de SM sont présentées. En un peu plus d'une heure, 42 échantillons, couvrant l'expérience de stabilité et les contrôles, ont été analysés. La chronologie montre des pics d'intensité des données SM pour chaque expérience d'infusion d'une minute, suivis de périodes sans données (correspondant au temps nécessaire au robot pour acheminer l'échantillon suivant vers le SM). Cette durée d'une heure est comparable au temps généralement requis pour l'analyse d'un seul échantillon par LC-MS traditionnelle.

L'analyse du peptide DTLMISR illustre le déroulement de l'analyse. La figure 5 présente les données de spectrométrie de masse (SM) de la méthionine oxydée dans la séquence peptidique DTLM(ox)ISR d'un anticorps thérapeutique. Une analyse LC-MS classique nécessiterait entre 30 et 120 minutes pour séparer le digestat protéique, suivies d'une analyse manuelle des données. En revanche, l'approche DI-MS/MS ne requiert qu'une minute d'analyse. Les deux peptides (état natif et état oxydé) sont séparés en phase gazeuse selon leur rapport masse/charge et détectés par un algorithme de décalage de masse automatisé. Le degré d'oxydation, déterminé par l'intensité ionique, est de 19.6 %, ce qui concorde parfaitement avec le résultat LC-MS. L'information est obtenue en un temps considérablement réduit.

Figure 4Exemple de séquence d'échantillons : 14 échantillons analysés en triplicata sur une durée d'un peu plus d'une heure. Les deux protéines (l'anticorps X et un anticorps monoclonal standard NIST) ont été exposées et testées dans différentes conditions (pH et température). Chaque analyse correspond à une minute d'infusion. Les données de spectrométrie de masse ont été collectées pour un traitement ultérieur, l'identification des peptides et l'analyse des modifications.

Figure 5Exemple d'analyse de données d'un acide aminé méthionine oxydé dans la séquence peptidique DTLMISR d'un anticorps thérapeutique. Une analyse LC-MS/MS classique nécessiterait 30 à 120 minutes pour séparer le digestat protéique, suivies d'une analyse manuelle des données. En revanche, l'approche par infusion directe MS/MS ne requiert qu'une minute d'analyse : les deux séquences peptidiques apparentées sont séparées en phase gazeuse et détectées par un algorithme automatisé de détection de décalage de masse. Le degré d'oxydation est déterminé par l'intensité ionique et calculé à 19.6 %, ce qui concorde parfaitement avec le résultat obtenu par LC-MS/MS, tout en étant obtenu beaucoup plus rapidement.

Conclusion

Advion Interchim Scientifique® TriVersa NanoMate® La source d'ions automatisée est l'outil idéal pour les flux de travail à haut débit dans la caractérisation des protéines thérapeutiques basée sur des stratégies de cartographie peptidique. En combinaison avec le CeleramAb™ Grâce à un kit de réactifs standardisé, des méthodes d'analyse par spectrométrie de masse et des logiciels d'analyse automatisés, nous pouvons obtenir une augmentation du débit d'un facteur 100 par rapport aux approches LC-MS standard, permettant d'analyser jusqu'à 1000 mAbs par jour.

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Purification éclair des glucides avec puriFlash® 5.030 et ELSD intégré

Fournisseurs d'instruments
Système de chromatographie flash : puriFlash® 5.030 avec pack iELSD
Colonne: puriFlash® 50 µm NH2 F0025

Auteur
Équipe des applications
Advion Interchim Scientifique

Introduction
Les glucides sont des composés non chromophores qui produisent souvent des signaux plats lorsqu'ils sont détectés uniquement par UV. Dans cette note d'application, nous présentons la purification des glucides par ELSD et l'intérêt de cette détection pour la purification.

Pourquoi utiliser ELSD d'Advion Interchim Scientific ?

    • Détecter les composés chromophores et non chromophores comme glucides
    • Faible entretien avec solvant d'appoint à base d'isopropanol pour ELSD
    • L'IPA envoie l'échantillon à l'ELSD
    • Nettoyage du système pendant le traitement de la purification => presque sans entretienRemplissage automatique
    • Élimine le risque de saturation du signal ou de non-détection
    • Permet de détecter et de collecter des composés à faible concentration
    • Installation facile (aucun paramètre à prévoir, facile à utiliser)
    • Gain automatique pour voir clairement tous les composés en même temps (Figure 1)
    • Faible consommation d'échantillon 40 µL/min
    • ELSD est un mode de détection destructif, grâce au contrôle automatisé de la quantité de séparateur envoyée au détecteur
    • Faible consommation de gaz (1 – 1.5 L/min à 1-1.5 bar)
    • Technologie basse température


    Figure 1: Le gain automatique permet aux utilisateurs de voir clairement tous les composés en même temps

    Méthode
    Configuration expérimentale
    Système de chromatographie flash : puriFlash® 5.030 avec pack iELSD
    Colonne puriFlash®: 50 µm NH2 F0025
    Échantillon : D(-)Fructose 100 mg
    Alpha (D)-Lactose 100 mg
    Détecteur : ELSD 35°C
    UV : 254 nm

    Résultats et discussion
    Signal ELSD

    Figure 2: ELSD montrant une bonne intensité de signal et un bon lissage.

    Signal UV 254 nm

    Balayage du signal UV 200-800 nm

    Figures 3 et 4 : Les composés ne sont pas visibles aux UV. Le scanner commence à montrer une faible intensité pour les premiers composés, mais pas suffisante pour obtenir une bonne collecte.

    Conclusion
    Les glucides sont des composés non chromophores et ne peuvent pas être détectés par UV, il est nécessaire d'utiliser un détecteur ELSD qui offre une bonne détection.

    Le détecteur ELSD proposé par AIS est capable de fournir plusieurs avantages à l'utilisateur :

  • pas besoin de définir le gain en fonction de la charge
  • Grâce à la technologie basse température, il est possible d'observer davantage de composés (notamment sensibles à la température ou volatils)
  • Dans cette application, nous avons utilisé de l'eau et 35°C ont suffi à éliminer la réponse de l'eau et à obtenir un signal plat.
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Spéciation avancée de l'arsenic dans l'eau par HPLC-ICP-MS

Instrumentation:
ICP: SOLATION® ICP-MS
LC: AVANT® (U) HPLC

Auteur :
Dr Fadi Abou-Shakra
Advion Interchim Scientifique®

Introduction
L'arsenic (As) est un élément toxique présent dans diverses matrices environnementales, notamment l'eau, le sol et les aliments. Sa toxicité dépend fortement de sa forme chimique. L'arsenic inorganique est une forme particulièrement toxique, fréquemment présente dans les sources d'eau, présentant des risques sanitaires importants tels que des lésions cutanées et des cancers. Par conséquent, la détection et la quantification précises des espèces d'arsenic inorganique sont essentielles pour garantir la salubrité de l'eau et la conformité aux normes réglementaires. La HPLC-ICP-MS est un outil analytique très performant pour réaliser ces analyses.

La HPLC-ICP-MS allie les capacités de séparation de la HPLC à la sensibilité de détection de l'ICP-MS. La HPLC sépare les espèces d'arsenic selon leurs propriétés chimiques, tandis que l'ICP-MS les détecte et les quantifie avec une sensibilité et une précision élevées.

La solution de spéciation Advion Interchim Scientific offre plusieurs fonctionnalités clés qui aident l'utilisateur final à développer des méthodes HPLC-ICP-MS robustes, notamment :
1. Un logiciel entièrement intégré qui contrôle à la fois le système ICP-MS SOLATION® et le système HPLC AVANT®. De plus, le logiciel ICP-MS Express permet de contrôler un détecteur UV-DAD pour une analyse en temps réel des données ICP-MS et UV, permettant ainsi à l'utilisateur final de résoudre tout problème chromatographique lors du développement de la méthode.
2. Routines de quantification avancées telles que des routines intégrées de dilution d'isotopes spéciés pour une précision ultime et des calculs semi-quantitatifs pour rendre compte de la concentration d'espèces inconnues.
3. Examen simplifié des données : qui permet de modifier à la volée les paramètres d'intégration des pics, accélérant ainsi le processus de développement de la méthode.
4. Rapports flexibles permettant la génération facile de rapports et simplifiant l'exportation des données pour l'intégration avec LIMS ou d'autres systèmes de données de laboratoire.
5. Commutation automatique de colonnes pour l'analyse de spéciation multi-éléments afin de permettre une analyse séquentielle sans surveillance de différents lots d'échantillons.

Méthodologie
Des espèces d'arsenic inorganique sous forme d'oxydes d'As(III) et d'As(V) solides, ainsi que du dihydrogénophosphate d'ammonium, ont été obtenues auprès d'Oakwood Chemicals, États-Unis. La séparation des deux espèces d'As a été réalisée sur un Advion Interchim Scientific.® Colonne C18, stratégie Uptisphere 100A, granulométrie 5 µm, longueur 250 mm et diamètre intérieur 3 mm. La phase mobile était composée de 5 mM de phosphate d'ammonium dihydrogéné et de 0.05 % d'acétonitrile, ajustés à pH 2.6.

Séparation et résultats
La figure 1 montre la séparation des deux pics d'arsenic inorganique ainsi que la réponse d'un pic d'étalon interne injecté pour corriger une éventuelle dérive au fil du temps. L'impact de l'utilisation du pic pour normaliser le signal sur la stabilité à long terme de l'analyse est mis en évidence dans la figure 2.


Figure 1: La séparation de As(III) et As(V) à l'aide d'une colonne C18.

La stabilité à long terme de la séparation est évaluée à l’aide de deux variables, la surface du pic et le temps de rétention des pics élués.

Figure 2 : Stabilité de l’aire du pic de 1 ppb d’As(V) sur 4 heures avec et sans normalisation. Bien que la stabilité à long terme pour des injections de 50 µL de 1 ppb d’As(V) sur 4 heures ait été inférieure à 10 %, la normalisation du signal en le rapportant à l’aire du pic injecté a amélioré cette précision à moins de 3 %.


Figure 2: Stabilité de la surface du pic pour 1 ppb d'As(V) sur 4 heures d'analyse. Une dérive vers le haut de la réponse est visible sur le graphique (carrés orange), corrigée avec succès grâce à l'utilisation d'un étalon interne (losange bleu).

D'autre part, en regardant la stabilité du temps de rétention comme le montre la figure 3, nous pouvons clairement voir que le temps de rétention des pics n'a pas dérivé au cours de la période d'analyse de 4 heures.


Figure 3: Stabilité du temps de rétention pour As(V) sur 4 heures avec et sans étalon interne, aucune dérive n'a pu être détectée.

Afin d'établir la limite de détection de la méthode, la figure 4 présente la liste des pics générée par le logiciel, listant les pics et leur rapport signal/bruit. Avec un rapport signal/bruit de 112 pour 1 ppb d'As(V), cela se traduit par des limites de détection inférieures à 30 ppt, calculées sur la base de 3 x le rapport signal/bruit.


Figure 4: Liste de pics générée à partir de 1 ppb As(V) et 0.25 ppb As(III) montrant d'excellents rapports S/B et soulignant la puissance de détection du système.

Conclusion
La HPLC-ICP-MS est une technique essentielle pour la spéciation de l'arsenic, fournissant des données précises et fiables, essentielles aux évaluations environnementales et de sécurité alimentaire. Dans ce dossier d'application, nous avons démontré la capacité de la solution de spéciation à utiliser SOLATION.® ICP-MS. Une séparation fiable et reproductible a été obtenue, et des limites de détection de l'ordre du ppt ont été facilement atteintes. L'automatisation complète du système permet à l'utilisateur d'analyser les échantillons sans surveillance et de traiter les données et de générer des rapports avec une intervention minimale.

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Surveillance efficace des réactions avec Advion Interchim Scientific ASAP-CMS pour les composés nécessitant une inversion de polarité en chimie médicinale

Instrumentation:
Spécification de masse : expression CMS®
Échantillonnage: Sonde d'analyse des solides atmosphériques – ASAP®
Logiciel: MassExpress

Auteurs
Changtong Hao, Ph.D.
Advion Interchim Scientifique

Introduction
En chimie médicinale, des techniques d'analyse rapides et fiables sont essentielles à la découverte de nouveaux médicaments. La spectrométrie de masse (MS) est une technique clé pour le suivi des réactions, fournissant des informations moléculaires essentielles sur un produit à chaque étape de sa découverte.

Les chimistes médicinaux rencontrent souvent des défis spécifiques lors de la surveillance des réactions, tels que :
– Ambiguïté du mode d’ionisation : Le manque d’informations préalables sur le mode d’ionisation optimal (positif ou négatif) peut conduire à des données incomplètes.
– Le développement de méthodes distinctes pour chaque mode d’ionisation peut retarder les progrès dans un domaine en évolution rapide qui exige des connaissances rapides.
– L’accès limité à des instruments ou à une expertise spécialisés peut également entraver l’analyse.

Système scientifique Advion Interchim
expression CMS® CMS avec solides atmosphériques
Sonde d'analyse (ASAP)®)

Méthode
Advion Interchim Scientifique® Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP®), intégré à l'expression CMS® Le spectromètre de masse compact (CMS) et le logiciel MassExpress utilisent une commutation de polarité rapide et des techniques d'introduction d'échantillons polyvalentes pour offrir une solution innovante à ces défis :

Commutation rapide de polarité : Transition transparente entre les modes d'ions positifs et négatifs, garantissant une capture complète des données sans changement de méthode.
Introduction à l'échantillon polyvalent : Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP®) permet l'analyse directe d'échantillons solides et liquides, réduisant ainsi le temps de préparation.
Intégrité des données améliorée : L’identification précise des composés ayant des préférences d’ionisation distinctes minimise le risque de manquer des informations critiques.

Voici le cas où le chimiste ne peut pas obtenir une détection réussie avec son analyse LC-MS traditionnelle de la réaction Surveillance avec détection de double polarité.

Scénario: Différenciation entre un réactif et son produit, chacun présentant un comportement d'ionisation exclusif.
Réactif (C5H2Br2O2S) : Détectable uniquement en mode ions négatifs, montrant des pics à de m / z 282.8, 284.8 et 286.8 affichant un modèle isotopique de brome caractéristique 1:2:1.
Produit (C6H4Br2O2S) : Indétectable en mode ions négatifs mais clairement observé en mode ions positifs à de m / z 298.8, 300.8 et 302.8, affichant également la même distribution isotopique classique du brome 1:2:1.


Figure 1: Chemin de réaction


Figure 2: A (en haut). Spectre MS du produit de départ en mode négatif. B (en bas). Spectre MS du produit en mode positif.

Grâce à la fonction de commutation rapide de polarité de l'ASAP-MS d'Advion Interchim Scientific, les deux composés ont été identifiés avec précision au cours d'une seule analyse, sans séparation HPLC. La durée totale d'analyse des échantillons était inférieure à 1 minute, ce qui permet de suivre la réaction au fil du temps.

Conclusion
Advion Interchim Scientifique® ASAP-MS, avec sa commutation de polarité rapide et son introduction d'échantillon efficace et polyvalente via la sonde d'analyse des solides atmosphériques (ASAP®), permet aux chimistes médicinaux de surveiller les réactions en toute confiance. Ce système robuste garantit qu'aucune donnée critique n'est négligée, simplifiant ainsi les flux de travail de découverte de médicaments et améliorant les processus décisionnels. Exploitez la puissance de la détection à double polarité avec Advion Interchim Scientific® ASAP-MS, car chaque détail compte dans la découverte de médicaments.

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Analyse qualitative des oligonucléotides à l'aide du ® Système HPLC-UV/MS de Advion Interchim Scientific

Fournisseurs d'instruments
Spécification de masse: expression CMS® Spectromètre de masse compact (CMS)
HPLC:AVANT®

Introduction

Les oligonucléotides ont suscité une attention considérable dans le développement biopharmaceutique en raison de leur
capacité à moduler l’expression d’un gène ou d’une protéine. Leur succès clinique est évident avec l’approbation de plusieurs médicaments à base d’oligonucléotides ou leur progression vers les essais cliniques.[1] Ces médicaments comprennent des oligonucléotides antisens, des produits thérapeutiques à petits ARN interférents (siARN) et des vaccins à base d'ARNm, illustrés par le développement réussi des vaccins contre la COVID-19. De telles réalisations ont stimulé davantage d’intérêt et d’investissements dans la recherche et le développement des oligonucléotides.

La synthèse en phase solide est une méthode couramment utilisée pour produire des séquences oligonucléotidiques. La matière première est généralement purifiée par diverses techniques, telles que le dessalage, l'ultrafiltration, l'extraction en phase solide (SPE), la chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou la chromatographie liquide préparative (prepLC), en fonction du niveau de pureté souhaité. Les méthodes HPLC ou prepLC par appariement d'ions sont souvent préférées car elles offrent une pureté plus élevée que les autres techniques.

Cette note d'application vise à démontrer l'analyse HPLC/UV de plusieurs échantillons d'oligo et à utiliser l'analyse HPLC/CMS pour déterminer leur poids moléculaire.

Méthode

Système HPLC-UV/CMS
Avec une pompe quaternaire et une vanne de sélection de colonne, le processus de commutation entre différents tampons et colonnes pour diverses analyses devient remarquablement simple, éliminant le besoin de procéder manuellement.
retirer la colonne et changer le solvant. Cette automatisation améliore considérablement l’efficacité et la commodité du processus analytique.

Tableau 1 : Liste des instruments d'articles


Amorce Oligo(dT) 12-18
L'amorce Oligo (dT) 12-18 (Thermos Fisher Scientific, MA) a été utilisée pour vérifier la méthode HPLC pour l'analyse des oligonucléotides.

La séparation de ces amorces Oligo (dT) 12-18 a été réalisée à l'aide d'une méthode HPLC en phase inverse par paire d'ions avec une colonne Interchim Uptisphere Strategy 5 µm C18HQ 250 x 4.6 mm. Une aliquote de 10 μL a été injectée pour toutes les analyses et la température de la colonne a été maintenue à 30 °C. La composition de la phase mobile A était de 100 mM de TEAA dans l'eau, tandis que la phase mobile B est de l'acétonitrile. Et le débit est de 1 ml/min.

L'analyse HPLC s'est déroulée comme suit : Après injection de l'échantillon, la phase mobile B a été fixée à 10 % pendant 1 minute. Elle a ensuite été augmentée linéairement jusqu'à 15 % sur 24 minutes. A 25.1 minutes, il est passé à 95 % et maintenu à ce niveau pendant 2.4 minutes pour nettoyer la colonne. Ensuite, à 27.6 minutes, elle a été réduite à 10 % et maintenue pendant 2.4 minutes pour l'équilibrage de la colonne.

La figure 1 montre que la méthode HPLC sépare efficacement les sept amorces Oligo(dT) 12 à 18.

Figure 1 : Analyse HPLC/UV d’Oligo(dT)12-18


Standard ARN à 4 composants
Le mélange d'oligonucléotides d'ARN (Aglient Technologies, CA) a été préparé en le diluant 10 fois avec de l'eau DI avant analyse HPLC. Les séquences de quatre normes d'ARN sont les suivantes : 14 mers (CACUGAAUACCAAU), 17 mers (UCACACUGAAUACCAAU), 20 mers (UCAUCACACUGAAUACCAAU) et 21 mers (GUCUCAUCACACUGAAUACCAAU).

La séparation de ces échantillons d'ARN a été réalisée en utilisant une méthode HPLC similaire à celle des amorces oligo (dT) 12-18, avec de légères modifications.

L'analyse HPLC s'est déroulée comme suit : Après injection de l'échantillon, la phase mobile B a été fixée à 9 % pendant 1 minute. Elle a ensuite été augmentée linéairement jusqu'à 10 % sur 24 minutes. A 25.1 minutes, il est passé à 95 % et maintenu à ce niveau pendant 2.4 minutes pour nettoyer la colonne. Ensuite, à 27.6 minutes, elle a été réduite à 9 % et maintenue pendant 2.4 minutes pour l'équilibrage de la colonne.

La figure 2 montre que la méthode HPLC sépare efficacement les quatre échantillons d'ARN, même avec une différence de 1-mer entre les échantillons d'ARN 20-mer et 21-mer. Cette séparation de base pour les 20-mer et 21-mer est cruciale pour l'analyse des oligonucléotides synthétiques, car la plupart des impuretés lors de la synthèse sont généralement N=1 mer ou N+1 mer.[2]


Échantillons d'ADNsb
Trois échantillons d'ADN simple brin (ADNsb) avec 17 mers (GTCAGCAAGGACATCGT), 18 mers (CATTTGAGTAGCCAACGC) et 19 mers (GGACACTTTCATGCGAGTT) ont également été testés en utilisant la méthode HPLC modifiée par rapport à celle utilisée pour les échantillons d'ARN.

La concentration de chaque ADNsb était de 30 µM et des aliquotes de 10 µL ont été chargées sur la colonne pour analyse. L'analyse HPLC a été réalisée en utilisant le gradient suivant : Après l'injection de l'échantillon, la phase mobile B (MPB) a été fixée à 9 % pendant 1 minute, puis augmentée linéairement jusqu'à 15 % sur 24 minutes. A 25.1 minutes, il est passé à 95 % et maintenu à ce niveau pendant 2.4 minutes pour nettoyer la colonne. Au bout de 27.6 minutes, le MPB a été réduit à 9 %, et ce niveau a été maintenu pendant 2.4 minutes pour l'équilibrage de la colonne. Le débit pour l'analyse a été réglé à 1.5 ml/min. Malgré le changement plus important du solvant B par minute par rapport aux échantillons d’ARN, la figure 3 démontre que la méthode sépare efficacement les trois échantillons d’ADN double brin avec une bonne résolution de base.

Figure 3 : Analyse HPLC/UV de trois échantillons d'ADNsb 1-3, trois échantillons d'ADN simple brin avec ADNsb-1 : 17 mers (GTC AGC AAG GAC ATC GT) ; ADNsb-2 : 18 mers (CAT TTG AGT AGC CAA CGC) et ADNsb-3 : 19 mers (GGA CAC TTT CAT GCG AGT T).


Analyse de pureté d'un échantillon d'ADNsb
Avec une même méthode utilisée pour les échantillons d'ADNsb présentée dans la figure 3, elle a également été utilisée pour l'analyse de pureté d'un échantillon d'ADNsb : 19 mer (5'-TGGCGGGCGTACCTGGACT-3').

La figure 4 révèle que l'ADNsb 19 de 4 mers a une pureté UV de 74.3 % à 260 nm, déterminée à l'aide du logiciel Advion Data Express.


Analyse MS de l'échantillon d'ADNsb utilisé dans l'analyse de pureté F.5
L'analyse HPLC/MS des oligonucléotides a été réalisée à l'aide d'un Advion AVANT® Système HPLC couplé à un Advion Expression CMS® CMS-L. Pour l'analyse MS, la colonne Interchim Uptisphere Strategy 2.6 µm C18-HQ de dimensions 50 x 2.1 mm a été utilisée, avec un débit de 0.2 ml/min. La température de la colonne a été réglée à 55°C.

Par rapport à l’utilisation du TEAA pour l’analyse de masse des oligonucléotides, les réactifs à paires d’ions combinant TEA et HFIP offrent des performances considérablement améliorées. Par conséquent, cette note d’application se concentrera sur l’utilisation des réactifs de paires d’ions TEA et HFIP pour l’analyse HPLC/MS des oligonucléotides.

La phase mobile était constituée de 15 mM de TEA et de 10 mM de HFIP dans de l'eau en tant que phase mobile A et de méthanol en tant que phase mobile B. La durée totale d'exécution de la HPLC était de 25 minutes, en commençant avec 5 % de solvant B pendant 1 minute.
Le pourcentage de B a ensuite été augmenté à 6 % sur 14 minutes, suivi d'une augmentation à 95 % à 15.1 minutes qui a été maintenue pendant 2.9 minutes pour éluer les composés d'intérêt. Par la suite, le % B a été réduit à 5 % et maintenu à ce niveau pendant 6.9 minutes pour équilibrer la colonne avant l'analyse suivante.

L'analyse MS a été réalisée en mode ESI négatif avec la plage de numérisation MS définie entre 500 et 2000 5 Da. La figure 4b montre les spectres MS de l'ADNsb-1463.9, affichant une enveloppe chargée avec des pics à m/z 4 (1170.8-), 5 (975.8-), (6 (936.0-), 7 (731.8-), 8 (650.2-). ) et 9 (5861.8-). Grâce à la déconvolution de charge dans Data Express, la masse non chargée de l'échantillon d'ADN simple brin a été déterminée comme étant de 5860.8 XNUMX Da, ce qui correspond étroitement à la valeur théorique de XNUMX XNUMX Da.

Figure 5 : Analyse HPLC/MS de l'ADNsb-4 (5-TGG CGG GCG TAC CTG GAC T-3), MW 5860.8 Da


Figure 6 : Analyse HPLC/MS de l'ADNsb-5 (5-GGGTGG-CAT-TAT-GCT-GAG-T-3), mw 5914.9


Analyse MS d'un autre exemple d'échantillon
Les spectres MS de l'ADNsb-5 (5'-GGG-TGG-CAT-TATGCT-GAG-T-3') sont représentés sur la figure 6, montrant une enveloppe chargée avec des pics à m/z 1477.8(4-), 1182.1( 5-), 984.7(6-), 843.8(7-) et 738.2(8-). Par déconvolution de charge, la masse non chargée de l'ADNsb-5 a été déterminée à 5913.9, ce qui est en accord étroit avec la valeur théorique de 5914.9.

Conclusion

L’utilisation d’une colonne C5HQ de taille de particules de 18 µm couplée au réactif d’appariement d’ions TEAA (acétate de triéthylammonium) s’est avérée être une solution appropriée pour l’analyse HPLC des oligonucléotides.

Pour l'analyse MS des oligonucléotides, la même colonne C18HQ peut être utilisée avec HFIP (hexafluoroisopropanol) et TEA (triéthylamine) comme réactif d'appariement d'ions en conjonction avec un AVANT® Système HPLC-UV/CMS. Il a été prouvé que cette méthode donne des mesures de masse supplémentaires et précises des oligonucléotides.

Dans l'ensemble, en utilisant la colonne Interchim C18HQ et le réactif d'appariement d'ions approprié en combinaison avec l'AVANT® Les systèmes HPLC-UV et -CMS peuvent fournir une solution fiable pour l'analyse de la pureté et la caractérisation des oligonucléotides.

Références
[1]Roberts, TC, Langer, R. & Wood, MJA Progrès dans l'administration de médicaments oligonucléotidiques. Nat Rev Drug Discov2020, 19, 673-694
[2]Martina C. et.al. Oligonucléotides : tendances actuelles et applications innovantes en matière de synthèse, de caractérisation et de purification, Biotechnology J. 2020, 1900226

Publié le

L'extraction, l'identification, la purification et la quantification du cyanidine-3-glucoside dans le riz noir

Fournisseurs d'instruments
Flash: puriFlash® 5.250, XS-Vap®
Spécification de masse : expression CMS® Spectromètre de masse compact (CMS)
HPLC : AVANTMC

Introduction
Le riz est l'un des aliments les plus essentiels au monde, en particulier dans les pays asiatiques. Parmi les variétés de riz pigmentées, le riz noir fait l'objet d'une attention croissante en raison de sa haute valeur nutritive et de ses propriétés bénéfiques pour la santé. Le riz noir est un riz pigmenté enrichi en anthocyanes qui contient de la cyanidine-3-glucoside (Cyn-3-Glu), de la cyanidine-3-rutinoside (Cyn-3-Rut), de la péonidine-3-glucoside (Pn-3-Glu) et d'autres anthocyanes. Le cyanidine-3-glucoside est l'anthocyanine dominante du riz noir.

Cette note d'application montre comment le cyanidine-3-glucoside est extrait du riz noir et purifié avec un système prepLC/Flash. La quantité et la pureté de Cyn-3-Glu sont mesurées à l'aide d'un étalon de référence certifié.

Méthode
Extraction de cyanidine-3-glucoside
Le riz noir a été acheté dans une épicerie locale, broyé en poudre fine avec un moulin à épices et extrait selon la méthode suivante :
1. 30 grammes de riz noir moulu ont été mélangés avec 200 ml de méthanol acidifié avec du HCl 1.0 N (85:15, v/v) et soniqués pendant 15 min.
2. Le mélange a été centrifugé à 7500 rpm à 4°C pendant 5 min. Le surnageant a été transvasé dans un flacon propre. Le culot a été extrait à nouveau avec 200 ml de méthanol acidifié avec du HCl 1.0 N (85:15, v/v) et soniqué pendant 15 min.
3. Le surnageant des deux extractions a été combiné et réduit à 25 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif.
4. Une petite partie de l'extrait concentré a été diluée 10x avec de l'eau pour l'analyse HPLC/UV/MS, le reste a été chargé directement sur un système PrepLC/Flash pour la purification.

Configuration analytique HPLC/UV/MS
Tableau 1: Méthode analytique HPLC/UV/MS pour l'extrait de riz noir.

Analyse HPLC/MS analytique de l'extrait de riz noir
L'extrait concentré de riz noir a été dilué 10x avec de l'eau distillée pour l'analyse HPLC/CMS.

Avec une plage de masse de 200 à 800 Da, le chromatogramme HPLC/MS est illustré à la figure 1a. Le spectre MS moyen à partir du pic à 12.10 min est illustré à la figure 1b avec un seul ion à de m / z 449.2 détecté en mode ESI positif. Le spectre MS avec CID dans la source est illustré à la figure 1c montrant un ion fragment de confirmation à de m / z 287.0

Figure 1: UN). Le chromatogramme HPLC/MS d'extrait de riz noir, B). Les spectres de masse moyens de pic à 12.10 min, C). Les spectres de masse moyens du pic à 12.10 min avec CID en source à 30V.

Recherche dans la base de données MS Spectra
Grâce à la recherche dans la base de données des spectres MS dans Advion Data Express, le composé élué à 12.1 min est confirmé comme cyanidine-3-glucoside (Cyn-3-Glu).

Figure 2: Résultat de la recherche dans la bibliothèque des spectres MS moyens dans l'extrait de la figure 1c.

Le logiciel Peak Express aide à détecter d'autres anthocyanes
Le logiciel Peak Express™ implémenté dans Data Express peut déterminer dynamiquement le taux de changement d'intensité et l'écart type de tous les ions détectés et n'afficher que les ions qui dépassent un seuil prédéfini.

Peak Express™ aide à détecter un autre pic à 14.41 min dans le chromatogramme ΔIC (Figure 3b) qui est à peine indiqué dans son chromatogramme TIC (Figure 3a). Le spectre ΔS Delta avec le CID dans la source montre deux ions détectés à m/z 463.3 et 301.1.

La recherche dans la base de données du spectre MS détermine qu'il s'agit de Peonidine-3-O-glucoside (le résultat de la recherche est illustré à la figure 4).

Figure 3: UN). Le chromatogramme HPLC/MS de l'extrait de riz noir, B). Le chromatogramme ΔIC de l'extrait de riz noir C). Le spectre ΔS Delta du pic à 14.41 min avec CID en source à 30 V

Figure 4: Le résultat de la recherche de bibliothèque du spectre ΔS Delta dans la figure 3c

Analyse HPLC/UV de l'extrait de riz noir
L'extrait de riz noir a également été analysé par HPLC/UV. Deux pics d'absorption UV caractéristiques de Cyn-3-Glu à 12.01 min se trouvent à 278 nm et 518 nm (figure 5b).

520 nm est utilisé pour déclencher la collecte de fractions dans la purification avec un système PrepLC/Flash.

Figure 5: UN). Le chromatogramme HPLC/UV de l'extrait de riz noir, B). Le profil d'absorbance UV à partir du pic à 12.07 min

Méthode PrepLC pour la purification du cyn-3-glu
Tableau 2: Méthode PrepLC pour la purification de Cyn-3-Glu

Purification
Les purifications d'extrait de riz noir sont effectuées sur un Advion Interchim Scientific puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash.

Les informations détaillées sur les solvants et la méthode de séparation sont répertoriées dans le tableau des méthodes. Le chromatogramme PrepLC/UV typique de l'extrait de riz noir (échantillon de 3 ml) est illustré à la figure 6.

Chaque fraction collectée est en outre analysée par HPLC-UV/MS pour confirmer l'identification et fournir une analyse de pureté supplémentaire.

Figure 6: Le chromatogramme prepLC (520 nm) de l'extrait de riz noir sur puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash

Analyse HPLC/UV des fractions 2, 5 et 8
Toutes les fractions sont analysées par HPLC/UV/MS. L'analyse HPLC/MS de la fraction 1 montre une impureté avec le m/z 611, et une faible réponse UV de Cyn-3-Glu. Et les fractions 2 à 8 ont une pureté de plus de 97.6 %. Les chromatogrammes HPLC/UV des fractions 2, 5 et 8 sont utilisés comme exemples illustrés à la figure 7 avec des puretés de 97.6 % pour 2, 100 % pour les fractions 5 et 8.

À l'exception de la première fraction, toutes les fractions ont été combinées pour la siccité. Le séchage des fractions a été réalisé sur un Advion Interchim Scientific puriFlash® Système XS-Vap à température ambiante. Le poids de Cyn-3-Glu purifié à partir de 30 g de riz noir est de 25.8 mg.

Figure 7: Le chromatogramme HPLC/UV des fractions a) Fraction 2, b) Fraction 5, c) Fraction 8.

Quantification du C3G par HPLC/UV
Pour confirmer la pureté finale de l'échantillon séché, un étalon de référence certifié de Cyn-3-Glu a été utilisé pour l'analyse quantitative de Cyn-3-Glu sec afin de vérifier sa pureté. La courbe d'étalonnage HPLC de la référence Cyn-3-Glu est illustrée à la figure 8.

La quantité mesurée de Cyn-3-Glu est de 25.5 mg avec une pureté de 99.0 %.

Figure 8: Courbe d'étalonnage HPLC/UV de l'étalon de référence Cyn-3-Glu

Conclusion
Avec les méthodes HPLC/UV/MS et PrepLC développées, le Cyn-3-Glu dans l'extrait de riz noir peut être séparé, purifié et quantifié.

25.5 mg de Cyn-3-Glu ont été purifiés à partir de 30 g de riz noir avec une pureté de 99.0 %.
La combinaison d'Interchim PrepLC/Flash et d'Advion HPLC-UV/CMS est une solution simple et économique pour extraire et purifier le Cyn-3-Glu à partir d'échantillons de riz ou d'échantillons contenant du Cyn-3-Glu.

Suite à ce flux de travail général :

HPLC/CMS fournit un moyen simple pour l'identification et l'analyse de la pureté des composés cibles dans la purification de produits naturels.

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Purification de peptides bioactifs à partir de mélanges complexes à l'aide du puriFlash® 5.250 PrepLC et expression CMS® Détecteur CMS

Fournisseurs d'instruments
Spécification de masse : expression CMS®
Flash: puriFlash® 5.250 prépLC
HPLC : AVANT®

Auteur
Changtong Hao
Advion Interchim Scientifique

Introduction
Ces dernières années, les sociétés biopharmaceutiques ont de plus en plus adopté les médicaments à base de peptides/protéines en raison de leur spécificité et de leur sélectivité accrues par rapport aux médicaments traditionnels à petites molécules. Cependant, la purification des peptides/protéines au cours du processus de découverte de médicaments est cruciale pour garantir la sécurité et l'efficacité du produit final. Atteindre les niveaux de pureté les plus élevés possibles pour les composés cibles bioactifs est essentiel pour minimiser le risque de toxicité et se conformer aux normes réglementaires.[1,2]

L'isolat de protéines de lactosérum, un sous-produit de la production de fromage, contient divers glycomacropeptides et deux peptides bioactifs importants, le macropeptide de caséine A (CMPa) avec un poids moléculaire (MW) de 6757 Da et le macropeptide de caséine B (CMPb) avec un MW de 6787 Da . Extraction et purification de composants individuels, tels que la caséine
macropeptide, est essentiel pour étudier leur bioactivité.[3]

Dans cette note d'application, nous utilisons un isolat de protéines de lactosérum et deux macropeptides de caséine comme exemple pour démontrer l'isolement et la purification de composants bioactifs avec un système composé d'un puriFlash® 5.250 prepLC couplé en ligne à un expression CMS® Détecteur CMS. Cette combinaison offre une sélectivité et une sensibilité plus élevées par rapport aux détecteurs traditionnels tels que les UV ou l'ELSD, qui peuvent ne pas répondre efficacement aux peptides et protéines cibles bioactifs.


Advion Interchim Scientifique
puriFlash® 5.250


Advion Interchim Scientifique
expression CMS®

Méthode
Préparation de l'isolat de protéines de lactosérum
• La procédure d'isolement des macropeptides de caséine utilisée dans cette application est basée sur les travaux de Tadao Saito[4] avec quelques modifications.
• Un échantillon de 50 g d'isolat de protéines de lactosérum acheté dans une épicerie locale a été combiné avec 500 ml d'un mélange de solvants composé de 70 % d'eau et de 30 % de méthanol (v/v). Le mélange a été soniqué à 70°C pendant 90 minutes puis filtré sous pression réduite.
• Le filtrat résultant a été concentré à un volume de 300 ml en éliminant le méthanol à l'aide d'un évaporateur rotatif sous pression réduite à 40 °C. Il a ensuite été stocké à 4°C pendant une heure. Ensuite, un volume égal d'éthanol froid a été ajouté à la solution, et le mélange a été vortexé pendant 5 minutes avant d'être stocké à 4°C pendant 4 heures supplémentaires.
• Le mélange a été filtré sous pression réduite à l'aide d'un filtre de 0.5 µm. Le filtrat final a ensuite été concentré jusqu'à un volume de 50 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif sous pression réduite.
• Une aliquote de 100 μL de l'extrait concentré a été mélangée à 900 μL de solution déionisée (DI)
l'eau pour l'analyse HPLC/MS analytique.
• Le filtrat restant a été utilisé pour la purification des peptides à l'aide du puriFlash® 5.250 Système PrepLC couplé à un expression CMS® Détecteur CMS.

Tableau 1: Configuration de la méthode analytique HPLC/MS

Configuration de la méthode analytique HPLC/MS
L'extrait liquide de l'isolat de protéines de lactosérum a d'abord été analysé à l'aide d'un AVANT® Système HPLC/CMS et méthode de séparation par chromatographie développée pour la colonne de 4.6 mm utilisée (tableau 1).

La figure 1a montre le chromatogramme HPLC/MS de l'extrait liquide. La moyenne des spectres MS à partir du pic à 6.44 min indique que le composé est un peptide chargé plusieurs fois avec au moins cinq masses à de m / z 755.2, 849.4, 970.6, 1132.1 et 1358.6 (Figure 1b) formant un profil de charge.

Grâce à la déconvolution de charge logicielle, la masse non chargée du peptide a été déterminée comme étant de 6787.4 Da, indiquant le macropeptide B de caséine (CMPb, masse théorique de 6787 Da) (Figure 1c).


Advion Interchim Scientifique
AVANT® (U) HPLC


Figure 1: ( a ) Chromatogramme HPLC / MS d'extrait liquide d'isolat de protéine de lactosérum, ( b ) Les spectres MS moyens du pic à RT 6.44 min, ( c ) La masse déconvoluée et non chargée du pic d'élution du peptide à RT 6.44 min.


Figure 2: ( a ) Chromatogramme HPLC / MS d'extrait liquide d'isolat de protéines de lactosérum, ( b ) Les spectres MS moyens du pic à RT 11.02 min, ( c ) La masse déconvoluée et non chargée du peptide éluant à RT 11.02 min.

Les spectres MS moyens obtenus à partir du pic d'élution à 11.02 min suggèrent que le composé est également un peptide chargé plusieurs fois avec des masses à m/z 751.5, 845.4, 966.1, 1126.8 et 1352.1 (figure 2b) formant son profil de charge.

De même, la déconvolution de charge détermine la masse non chargée de ce peptide à 6755.3 Da indiquant la variante A du macropeptide de caséine, CMPa avec une masse théorique de 6755 Da (Figure 2c).


Advion Interchim Scientifique
puriFlash® 5.250, séparateur MS et expression CMS®

Chromatographie PrepLC/MS
Dans une étape suivante, la méthode de séparation analytique a été transposée à une plus grande échelle de préparation d'un ID de colonne de 4.6 mm à un ID de colonne de 30 mm et optimisée pour la purification des deux CMP (glyco-macropeptides de caséine) sur le puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash couplé en ligne à l'expression CMS® Détecteur CMS.

Le chromatogramme PrepLC-UV/MS de l'isolat de protéines de lactosérum est illustré à la figure 3 et les paramètres indiqués au tableau 2.

La collecte de fractions a été déclenchée sur la base du signal MS, choisi pour sa sélectivité et sa sensibilité plus élevées. XIC de 970-971 Da a été utilisé pour détecter CMPb, et XIC de 965-966 Da pour CMPa.

Le solvant organique de la combinaison des fractions 11 à 17 et de la fraction 18 à 22 a été éliminé à l'aide d'un évaporateur rotatif sous pression négative, et la solution aqueuse restante
La solution a été séchée à l'aide d'un lyophilisateur LABCONCO Freezone 2.5 L (-50 C), ce qui a donné une collection sèche de 10 mg chacun, qui a ensuite été dissoute dans 10 ml d'eau désionisée pour une analyse HPLC/UV/MS ultérieure. Les résultats de l'analyse de pureté sont présentés dans les figures 4 et 6.

Tableau 2: Configuration de la méthode PrepLC/MS


Figure 3: Le chromatogramme PrepLC-UV/MS de deux isolats de protéines de lactosérum

Résultats

Analyse de pureté du CMPb
L'analyse de pureté de CMPb dans les fractions regroupées 11 à 17 est illustrée à la figure 4. L'analyse MS montre que quatre ions majeurs ont été détectés avec m/z à 970.8, 1132.3, 1358.6 et 1968.2 (figure 4b).

Avec les spectres de masse moyens de la figure 4b, la masse non chargée du pic à 5.94 min a été déterminée comme étant de 6788.4 (CMPb, figure 4c). Cependant, l'analyse MS peut également détecter quatre composants mineurs à 6758.3, 6773.5, 6804.8 et 6868.4 Da.

La pureté UV obtenue de CMPb est de 86.7 % (figure 4d), mais, sur la base des données MS supplémentaires, la pureté du composé est en fait inférieure à celle (estimée à 80 %).

Le CMPa dans les fractions regroupées 18 à 22 a été mesuré à 94.7 % (figure 5a) sur la base de l'analyse UV de l'analyse.

L'analyse de masse non chargée déconvoluée montre la masse dominante attendue de 6756.2 de CMPa (figure 5b) et un composant mineur à 6774.6, une forme oxydée de CMPa.

Encore une fois, cet exemple montre la valeur de la détection MS de composés bioactifs tels que les peptides et les protéines, et la meilleure spécificité de la détection MS par rapport aux UV.


Figure 4: (a) Le chromatogramme HPLC-MS des fractions regroupées de 11 à 17, (b) Moyenne des spectres MS du pic éluant à RT 5.94 min, (c) la masse non chargée de (b), (d) Le chromatogramme HPLCUV des fractions regroupées du 11 au 17.


Figure 5: ( a ) Le chromatogramme HPLC-UV des fractions regroupées de 18-22. (b) masse non chargée déconvoluée de CMPa.

La pureté globale finale est estimée à env. 90 %, une excellente valeur pour une molécule bioactive dans la découverte de médicaments.

Une amélioration supplémentaire de la pureté peut être obtenue avec des fractions sélectives - au détriment du rendement. Par exemple, l'analyse HPLC-UV/MS de la fraction 20 de CMPa (Figure 6a) montre une pureté UV de 99.0 % (Figure 6d) et aucun sous-produit oxydé dans l'analyse MS.


Figure 6: ( a ) Le chromatogramme HPLC-MS de la fraction 20, ( b ) Moyenne des spectres MS du pic à RT 5.71 min, ( c ) masse non chargée déconvoluée de CMPa ( d ) Le chromatogramme HPLCUV des fractions 20.

Conclusion
Le puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash, couplé en ligne avec un expression CMS® Le détecteur CMS atteint des performances exceptionnelles, facilitant la purification sélective de macropeptides bioactifs à partir d'une matrice complexe avec un niveau de confiance élevé. Comparé aux détecteurs UV ou ELSD, le spectromètre de masse offre une sélectivité et une sensibilité supérieures.

Une application illustrative de cette approche montre l'isolement de caséine glycol-macro-peptides, résultant en une gamme de pureté de 80% (CMPb) à 90% (CMPa) à travers des fractions combinées avec un rendement élevé. Une pureté encore plus élevée allant jusqu'à 99.0 % peut être obtenue avec des fractions sélectives.

 

Références

[1]Gräslund, S., et al. (2008). Production et purification de protéines. Méthodes naturelles, 5(2), 135-146.
[2]Traitement biopharmaceutique : développement, conception et mise en œuvre de procédés de fabrication.
[3]Lin T., et al. (2021) Bioactifs dans le lait de vache : chimie, technologie et applications Nutrition Reviews v79(S2):48–69
[4]Saito T., euh al. (1991) Une nouvelle méthode d'isolement de caséinoglycopeptide à partir de lactosérum de fromage doux. J. Dairy Sci. 74, 2831-2837

Publié le

Analyse de sang à l'aide de l'Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS

Introduction

Les oligo-éléments sont essentiels au bon fonctionnement biologique chez l'homme, et différents niveaux d'oligo-éléments sont révélateurs de nombreuses maladies et affections. Des oligo-éléments non essentiels sont également présents dans le corps humain en raison de contaminants environnementaux générés par des activités humaines ou industrielles déposés dans le sol, l'air, l'eau et les denrées alimentaires. Ces oligo-éléments essentiels et non essentiels sont facilement mesurés et surveillés dans le sang, le sérum et l'urine à l'aide de l'ICP-MS.

Dans cette note d'application, nous présentons une méthode rapide pour l'analyse de routine d'échantillons de sang de petit volume pour les principaux éléments toxiques et essentiels à l'aide du SOLATION® Spectromètre de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) utilisant une simple préparation d'échantillon "diluer et tirer". La sensibilité élevée et la large plage dynamique de l'ICP-MS sont particulièrement importantes pour la détermination des niveaux de traces de métaux lourds, tout en mesurant simultanément les éléments pertinents sur le plan nutritionnel à des niveaux plus élevés. Le sang est une matrice complexe, riche en protéines et en sels qui favorisent la formation d'interférences à base de carbone et de chlore qui affectent de nombreux analytes. La cellule de collision sur SOLATION d'Advion Interchim Scientific® L'ICP-MS est nécessaire pour surmonter ces interférences.

Le SOLAT® L'ICP-MS possède une cellule de collision octupôle qui est utilisée pour traiter les interférences des ions polyatomiques, en particulier pour les éléments de métaux de transition. Il est essentiel pour une analyse robuste et de routine des éléments traces que la cellule octupôle ne soit pas contaminée, ce qui pourrait entraîner une dérive et des temps d'arrêt inutiles. Les ions traversant l'interface sont dirigés à travers un virage à 90˚ et focalisés sur l'entrée de l'octupôle à l'aide d'un déflecteur quadripolaire (QD). Les particules légères et neutres continuent à travers le QD et loin de la cellule.

La cellule de collision dans la SOLATION® L'ICP-MS peut fonctionner en mode "He Gas" dans lequel la cellule est remplie d'He pour agir comme un gaz de collision, ou en mode "No Gas" dans lequel la cellule est vide. Le mode « He Gas » est utilisé pour les isotopes soumis à des interférences polyatomiques tandis que le mode « No Gas » est utilisé pour le reste des isotopes. La commutation rapide entre les modes "He Gas" et "No Gas" sur le SOLATION® (< 5 sec) garantit que les cycles d'analyse peuvent être courts, améliorant ainsi la productivité.

Expérience et résultats

Réactifs et matériaux

Acide nitrique (Aristar Plus, qualité traces de métaux)
Triton X-100 (spécialement purifié, Roche Chemical)
Eau, type 1 (18.2 MΩ, système de point d'utilisation Elga)
Méthanol (hypergrade pour LC-MS, Supelco)
Solutions étalons de Mg, Ca, Mn, Cu, As, Se, Cd, Pb, Ge, Rh, Au et Ir (1000 μg/ml, qualité Claritas ppt) 
Oligo-éléments Sang total L-1 (SRM1) (Seronorm)
Oligo-éléments Sang total L-2 (SRM2) (Seronorm)
Oligo-éléments Sang total L-3 (SRM3) (Seronorm)
Sang total blanc (WB(F)) (UTAK)
Diluant acide : (0.5 % d'acide nitrique, 0.05 % de Triton X-100, 2 % de méthanol, 0.25 μg/mL (ppm) Au et les étalons internes : 10 μg/L (ppb) Ge, Rh et Ir)

Tableau 1: Étalonnage et concentrations standard

Normes

La méthode a été développée pour déterminer Mg, Ca, Mn, Cu, As, Se, Cd et Pb dans des échantillons de sang total. Les éléments ont été choisis pour représenter certains des métaux couramment mesurés dans le sang, couvrant à la fois les éléments essentiels et toxiques. Les étalons ont été préparés en utilisant le diluant acide avec des éléments à quatre niveaux de concentration pour couvrir la gamme généralement observée dans le sang. Le tableau 1 présente les concentrations standard à chaque niveau et les éléments qui se trouvent à ce niveau. Le mode d'analyse et l'étalon interne utilisés pour chaque analyte figurent dans le tableau 2. Les directives de l'ICH exigent un minimum de cinq concentrations pour établir la linéarité ; avec le blanc d'étalonnage, nous en utilisons six, satisfaisant à cette exigence.

Tableau 2: Mode d'analyse et étalons internes

Échantillons et préparation

Les échantillons ont été préparés dans des tubes à centrifuger sans métal de 15 ml. Un diluant acide (14.7 ml) a été ajouté à chaque tube, suivi d'un échantillon de sang de 0.3 ml pour une dilution de 1:50. Les tubes ont été bouchés et retournés 3 à 5 fois pour bien mélanger.

Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un SOLATION® ICP-MS. La SOLATION® La configuration de l'instrument pour cette analyse était une chambre de nébulisation cyclonique avec un nébuliseur concentrique Micromist et une torche monobloc. Des cônes d'échantillonnage et d'écumage de Ni ont été utilisés tout au long de l'étude. Les conditions de fonctionnement de l'instrument sont résumées dans le tableau 3.

Tableau 3: Paramètres de fonctionnement ICP-MS

Résultats et discussion

Nous avons suivi les directives ICH "Validation of Analytical Procedures" pour la validation des méthodes qui définissent les exigences spécifiques en matière d'exactitude, de précision (répétabilité), de limite de détection et de limite de détection de la méthode (DL et MDL) et de limites de quantification (LOQ). 

La précision de la méthode a été établie à l'aide des matériaux de référence Seronorm, qui avaient des valeurs de concentration certifiées pour tous les éléments de la méthode. Ces matériaux ont été mesurés en triple et les résultats analytiques ont été comparés aux valeurs certifiées et aux limites de confiance à 95 % fournies par Seronorm. 

Ces valeurs sont tracées sur la figure 1 où les valeurs minimales et maximales certifiées sont représentées sous forme de boîte. Nos valeurs analytiques sont tracées dans la figure 1, et dans chaque cas, nos valeurs se situent à l'intérieur des limites indiquant un haut degré de précision qui répond facilement aux spécifications ICH.

Une deuxième mesure de précision est la récupération des pointes. L'échantillon de « sang blanc » (WB(F)) de l'UTAK a été dopé avec 150 μL de la solution étalon mère pour tous les éléments sauf Ca et Mg dans le tube de 15 mL. La récupération est calculée comme suit : 

Les récupérations de dopage sont présentées dans le tableau 4. Toutes les récupérations se situent entre 90 et 110 %, ce qui indique une excellente récupération des analytes dopés.

Tableau 4: Récupérations de pics

La précision de la méthode est mesurée par la répétabilité de six échantillons de niveau séronorme 2 (SRM2). Six échantillons de Seronorm niveau 2 (SRM2) ont été préparés, dilués et analysés individuellement. Les résultats montrent moins de 3 % de RSD parmi les répliques. Le % RSD des six répliques est présenté à la figure 2.


Figure 1: Précision de l'analyse des matériaux certifiés Seronorm


Figure 2: Précision de l'analyse des matériaux Seronorm

La limite de détection de la méthode (MDL) et la limite de quantification (LOQ) ont été déterminées à l'aide de l'écart type (σ) du signal de huit blancs de diluant acide. Les blancs de diluant acide ont été préparés en utilisant la même technique et le même équipement que les échantillons et ont été inclus à la fin de chaque analyse, suivis d'un standard d'étalonnage. La MDL et la LOQ sont calculées comme suit : 

où S est la pente d'étalonnage, et :

Étant donné que la pente d'étalonnage était l'analyte par rapport à un étalon interne, l'étalon d'étalonnage a été utilisé pour déterminer les coups/seconde/ppb. Ces valeurs sont calculées, multipliées par 50 pour tenir compte du facteur de dilution et exprimées en μg/L (ppb). Dans le tableau, la MDL et la LOQ sont tracées par rapport aux valeurs normales physiologiques représentées par Seronorm 2 (SRM2). Pour la plupart des analytes, la MDL et la LOQ sont minuscules en comparaison, en particulier pour les éléments majeurs que sont le calcium et le magnésium. Cependant, même pour les analytes plus difficiles tels que le sélénium, le MDL est d'un ordre de grandeur inférieur à Seronorm 2 (SRM2) qui, bien qu'étant de niveau 2 (SRM2), a la teneur en sélénium la plus faible de ces trois SRM. 


Figure 3: LOQ et MDL par rapport aux valeurs normales physiologiques
*tel que représenté par Seronorm L2, formulé pour représenter des valeurs humaines typiques ou moyennes.

Conclusion

Dans cette note d'application, nous rendons compte de l'analyse des oligo-éléments dans le sang à l'aide de l'Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS. Le sang est une matrice complexe et exigeante. Cependant, ces données appuient l'utilisation d'une méthode de préparation d'échantillon simple «diluer et tirer» qui donne des concentrations exactes et précises pour les éléments à haut niveau et à l'état de traces dans le sang. D'excellentes récupérations ont été observées pour les échantillons dopés et les MRC. La combinaison du déflecteur quadripolaire et de la cellule de collision minimise la dérive et assure l'exactitude et la précision dans le temps. La méthode rapportée bénéficie des capacités de commutation de gaz de la cellule de collision rapide de la SOLATION® pour analyser un large éventail d'éléments dans le sang pour des résultats rapides, précis et reproductibles.

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Analyse de l'Iohexol à l'aide de l'Advion Interchim Scientific AVANT® HPLC et expression CMS® CMS

Introduction

L'iohexol est un agent d'imagerie non ionique largement utilisé qui améliore le contraste pour l'analyse aux rayons X. Sa faible osmolalité permet une clairance rapide par le rein, empêchant la réabsorption et la métabolisation ultérieure[1]. Cela fait de l'iohexol un composé avec un meilleur profil d'innocuité par rapport aux autres agents d'imagerie[2]. 

Dans de nombreuses applications d'imagerie clinique, des agents d'imagerie/agents de contraste sont administrés aux patients pour améliorer le contraste et la résolution spatiale du balayage. En raison de la toxicité et des effets secondaires de l'agent d'imagerie, les préparations de leurs concentrations connues et leur analyse de pureté sont très importantes pour leur utilisation sûre et leur diagnostic précis. 

Dans cette note d'application, une méthode HPLC-CMS simple et précise pour l'analyse des iohexols est présentée.

Méthode

Configuration de la méthode

Tous les solvants utilisés dans l'application étaient de qualité HPLC.

Deux étalons Iohexol ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich.

L'un était un matériau de référence certifié d'une pureté de 99.99 %, le second avait une pureté déclarée ≥ 95 %.

Toutes les expériences ont été réalisées sur un Advion Interchim Scientific® expression CMS® Spectromètre de masse compact couplé à un AVANT® Système UHPLC avec les paramètres indiqués dans le tableau 1.

Tableau 1: Méthode HPLC/MS

Analyse HPLC/UV/MS de l'Iohexol

À température ambiante, l'iohexol s'isomérisera avec deux pics détectés dans son analyse HPLC/UV/MS. 

Ces deux pics (figure 1A) proviennent d'une rotation entravée du groupe anilide N-acétyle en raison des atomes d'iode volumineux attachés au cycle benzénique central de l'iohexol. Ces deux composés sont essentiellement des "isomères de rotation" qui s'échangent lentement à température ambiante en solution aqueuse.

Les deux pics sont confirmés par analyse MS pour montrer le même m/z à 821.9 (Figure 1B et 1C) et aucune différence n'était visible dans leurs spectres de masse CID en source (Figure 2A et 2B). 

Étant donné que les deux rotamères contribuent à la toxicité des composés et aux capacités d'amélioration de l'imagerie dans l'analyse aux rayons X, la somme des deux pics sera utilisée pour toute autre analyse d'iohexol dans cette note d'application. 


Figure 1: (A) Chromatogramme HPLC (254 nm) de l'iohexol, (B) Le chromatogramme ionique d'extraction de l'iohexol protoné à m/z 821.8, (C) La moyenne des spectres MS à partir du pic à RT 4.06 min.


Figure 2: (A) La moyenne des spectres de masse CID dans la source à partir du pic à RT 3.61 min, (B) La moyenne des spectres de masse CID dans la source à partir du pic à RT 4.06 min.

Détermination de la pureté par analyse HPLC/UV

En comparant la réponse HPLC de l'échantillon d'iohexol à la réponse de l'étalon certifié iohexol à une concentration similaire, le rapport de surface de pic de l'échantillon à l'étalon certifié peut fournir une analyse rapide de la concentration et de la pureté. 

L'équation pour calculer le rapport de concentration de l'iohexol est présentée ci-dessous :

Les chromatogrammes HPLC de l'échantillon d'iohexol et de la référence certifiée sont illustrés aux figures 3A et 3B.

La valeur moyenne des deux zones de pic additionnées est de 714 pour l'échantillon d'iohexol (figure 3A) et de 740 pour l'étalon de référence d'iohexol (figure 3B). Avec le calcul du rapport de concentration, la concentration calculée d'iohexol dans l'échantillon est de 0.0964 mg/ml, ce qui équivaut à une pureté de 96.4 % - conformément à la pureté du produit indiquée de ≥ 95 %.


Figure 3: (A) chromatogramme HPLC (254 nm) de l'échantillon d'iohexol (0.1 mg/ml) (B) chromatogramme HPLC (254 nm) de l'étalon de référence iohexol (0.1 mg/ml).

Quantification par analyse HPLC/UV

Pour vérifier plus précisément la pureté d'un échantillon d'iohexol, une courbe d'étalonnage du matériau standard certifié iohexol a été créée avec cinq niveaux de dilution différents de 25 à 500 μg/mL et avec des injections en triple pour chaque concentration. La valeur R au carré de la fonction d'étalonnage linéaire résultante est de 0.9999 (Figure 4) montrant une excellente linéarité. 

Au moyen de l'approche de la courbe d'étalonnage de l'iohexol, la pureté de l'échantillon d'iohexol a été déterminée comme étant de 97.5 %. 

Cette valeur est également juste au-dessus de la pureté indiquée de min 95 % de l'échantillon et ne diffère que de 1.1 % de la valeur mesurée par l'analyse directe du rapport de réponse UV de l'échantillon d'iohexol à l'étalon de référence d'iohexol.

La détermination de la pureté au moyen d'une fonction d'étalonnage ou par analyse directe du rapport de réponse UV peut être utilisée pour les produits chimiques organiques avec des absorbances UV si un matériau standard de référence certifié est disponible.

La méthode de la fonction d'étalonnage fournira une mesure plus précise.


Figure 4: Courbe d'étalonnage de l'iohexol par chromatogramme HPLC (254 nm)

Conclusion

L'AVANT Scientifique Advion Interchim® Le système (U)HPLC peut fournir des méthodes chromatographiques précises pour l’analyse de la pureté des agents d’imagerie, comme indiqué pour l’iohexol. Couplage de l'UHPLC avec l'Advion Interchim Scientific expression CMS® Le spectromètre de masse compact fournit non seulement des confirmations des composés cibles via leur masse et modèle de fragmentation à la source, mais permet également une détermination rapide des impuretés. 

Références
[1] T. Almen, Développement de produits de contraste non ioniques., Invest. Radiol. (1985) Radiologie d'investigation. 1985, 20(1), S2-S9.
[2] RD Moore, EP Steinberg, NR Powe, RI White, JA Brinker, EK Fishman, SJ Zinreich, CR Smith, Fréquence et déterminants des effets indésirables induits par les produits de contraste à haute osmolalité., Radiologie. 1989, 170, 727-32.

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Extraction et purification de 3 curcuminoïdes à partir de poudre de curcuma

Instrumentation:
Flash: puriFlash® XS520
CCM : Plate Express™ Lecteur de plaque CCM
Spécification de masse : expression CMS® Spectromètre de masse compact
Échantillonnage: ASAP® Sonde d'analyse directe

Introduction

Les curcuminoïdes sont des composés polyphénoliques naturels dérivés de la racine de curcuma (Curcuma longa). On rapporte qu'ils ont des activités antioxydantes1. La curcumine est le principal curcuminoïde présent dans le curcuma. Il est couramment utilisé comme ingrédient dans les compléments alimentaires et les cosmétiques, comme arôme dans les plats culinaires et comme colorant alimentaire jaune-orange.

Dans cette note d'application, une méthode pour séparer et purifier 3 curcuminoïdes de la poudre de curcuma en utilisant la chromatographie flash avec le Advion Interchim Scientific puriFlash® XS520 Plus, TLC avec spectrométrie de masse avec le lecteur de plaques Plate Express™ TLC et expression CMS® CMS est démontré. Les fractions ont été identifiées à l'aide de la sonde d'analyse des solides atmosphériques (ASAP®).

Extraction de curcuminoïdes

La poudre de curcuma a été pesée (57.3 g) et transférée dans une bouteille en verre à large ouverture. De l'éthanol (250 ml, 200 proof) a été ajouté à la bouteille et le mélange a été agité pendant 18 heures tout en étant recouvert d'une feuille. Les composés d'intérêt sont sensibles à la lumière. La bouillie a ensuite été filtrée et le filtrat a été concentré à sec pour former une huile ambrée (6.4 g).

Figure 1: Structures des curcuminoïdes.

Figure 2: Poudre de curcuma achetée en magasin (à gauche) et huile d'extrait brut (à droite).

Analyse CCM/SM

L'Advion Interchim Scientific Plate Express™ associé à l'expression CMS® Le CMS permet une identification facile des taches sur les plaques TLC sans avoir besoin de purification ou de préparation d'échantillon (Figure 3).

L'analyse TLC initiale a montré 4 points (dichlorométhane : méthanol, 97 : 3). Les trois taches inférieures étaient hautement fluorescentes, comme prévu pour les curcuminoïdes d'intérêt. Les spots TLC ont été analysés par ionisation APCI en mode ions négatifs. Les 3 taches inférieures ont été caractérisées par spectrométrie de masse.

Figure 3: Advion Interchim Scientific expression CMS® Lecteur de plaques CMS et Plate Express™ TLC (à gauche) et gros plan de la tête d'extraction de plaques TLC (à droite).

Figure 4: Plaque TLC développée visualisée à 365 nm. Spectres de masse résultants du curcumin (en haut), de la déméthoxycurcumine (au milieu) et de la bisdéméthoxycurcumine (en bas).

Épuration éclair

Une méthode isocratique a été utilisée car la séparation montrée sur TLC était optimale telle quelle. Le matériau brut a été purifié sur une colonne de gel de silice sphérique de 25 g, 15 μm (PF-15SIHC-F0025). Un poids brut de 64 mg a été chargé à sec sur 500 mg de gel de silice et chargé dans une cartouche de charge sèche de 4 g (PF-DLE-F0004).

Figure 5: Chromatogramme flash résultant de la plaque TLC développée.

Identification des fractions par ASAP®/CMS

L' expression CMS® CMS avec l'ASAP® La sonde d'analyse directe permet une identification facile des composés sans avoir besoin de LC/MS ou de préparation d'échantillon.

Les fractions pures (1.1, 1.3 et 1.5) ont été analysées à l'aide de l'ASAP® sonde avec ionisation APCI et polarité positive CMS. Les curcuminoïdes s'ionisent bien en polarité APCI positive et négative, cependant (M + H)+ les ions ont montré moins de fragmentation. Les masses détectées sont cohérentes avec les [M+H] théoriques+ valeurs m/z.

Figure 6: Advion Interchim Scientifique ASAP® La sonde d'analyse directe est insérée directement dans la source d'ions compatible APCI de l'expression CMS® .

Figure 7: Spectres de masse des fractions.

Les fractions purifiées ont été concentrées à sec pour donner respectivement les solides I (14.1 mg), II (5.6 mg) et III (6.7 mg) qui représentent la curcumine (I), la déméthoxycurcumine (II) et la bisdéméthoxycurcumine (III) à 53.4%, 21.2 % et 25.3 % du profil curcuminoïde isolé. Ces résultats sont cohérents avec les valeurs rapportées dans la littérature2.

Confirmation de la pureté du composé par RP-HPLC

Figure 8: Balayage UV du mélange de fractions purifiées.

La chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) permet une confirmation séparée de la pureté du composé après la chromatographie flash. Un mélange égal des trois composés a été combiné et exécuté sur un Phenomenex Kinetex® 5 μm Colonne de biphényle 100 Å 50 x 2.1 mm utilisant ACN:eau isocratique (v:v, 55:45) avec 0.2 % d'acide formique. Comme prévu, l'ordre d'élution des trois curcuminoïdes a changé d'ordre avec maintenant l'élution III, II et I (Figure 8). Après avoir développé cette méthode, la fraction collectée unique respective a été injectée et analysée pour la pureté et à nouveau confirmée par analyse MS.

Figure 9: Balayage UV et spectre de masse de la fraction de curcumine 1.1.

Figure 10: Balayage UV et spectre de masse de la fraction de curcumine 1.3.

Figure 11: Balayage UV et spectre de masse de la fraction de curcumine 1.5.

Conclusion

Grâce à une combinaison de support de chromatographie TLC, de chromatographie flash et de spectrométrie de masse à différentes étapes du processus (identification de plaque TLC, confirmation de fraction et analyse de pureté secondaire), nous pouvons purifier les curcuminoïdes à partir de poudre de curcuma à des niveaux de pureté confirmés > 95 %.

Références:
1Jayaprakasha et al. Activités antioxydantes de la curcumine, de la déméthoxycurcumine et de la bisdéméthoxycurcumine. Chimie alimentaire, volume 98, numéro 4, 2006, pages 720-724. ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2Praveen et al. Approche RMN Facile pour le profilage des curcuminoïdes présents dans le curcuma, Food Chemistry, Volume 341, Part 2, 2021, 128646, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.128646.