Extraction et purification de 3 curcuminoïdes à partir de poudre de curcuma
Instrumentation:
Flash: puriFlash® XS520
CCM : Assiette Express™ Lecteur de plaque TLC
Spécification de masse : exPression® Spectromètre de masse compact
Échantillonnage: au plus vite® Sonde d'analyse directe
Introduction
Les curcuminoïdes sont des composés polyphénoliques naturels dérivés de la racine de curcuma (Curcuma longa). On rapporte qu'ils ont des activités antioxydantes1. La curcumine est le principal curcuminoïde présent dans le curcuma. Il est couramment utilisé comme ingrédient dans les compléments alimentaires et les cosmétiques, comme arôme dans les plats culinaires et comme colorant alimentaire jaune-orange.
Dans cette note d'application, une méthode pour séparer et purifier 3 curcuminoïdes de la poudre de curcuma en utilisant la chromatographie flash avec le Advion Interchim Scientific puriFlash® XS520 Plus, TLC avec spectrométrie de masse avec le lecteur de plaques Plate Express™ TLC et exPression® CMS est démontré. Les fractions ont été identifiées à l'aide de la sonde d'analyse des solides atmosphériques (ASAP®).
Extraction de curcuminoïdes
La poudre de curcuma a été pesée (57.3 g) et transférée dans une bouteille en verre à large ouverture. De l'éthanol (250 ml, 200 proof) a été ajouté à la bouteille et le mélange a été agité pendant 18 heures tout en étant recouvert d'une feuille. Les composés d'intérêt sont sensibles à la lumière. La bouillie a ensuite été filtrée et le filtrat a été concentré à sec pour former une huile ambrée (6.4 g).
Figure 1: Structures des curcuminoïdes.
Figure 2: Poudre de curcuma achetée en magasin (à gauche) et huile d'extrait brut (à droite).
Analyse CCM/SM
L'Advion Interchim Scientific Plate Express™ associé à l'exPression® Le CMS permet une identification facile des taches sur les plaques TLC sans avoir besoin de purification ou de préparation d'échantillon (Figure 3).
L'analyse TLC initiale a montré 4 points (dichlorométhane : méthanol, 97 : 3). Les trois taches inférieures étaient hautement fluorescentes, comme prévu pour les curcuminoïdes d'intérêt. Les spots TLC ont été analysés par ionisation APCI en mode ions négatifs. Les 3 taches inférieures ont été caractérisées par spectrométrie de masse.
Figure 3: Advion Interchim Scientific exPression® Lecteur de plaques CMS et Plate Express™ TLC (à gauche) et gros plan de la tête d'extraction de plaques TLC (à droite).
Figure 4: Plaque TLC développée visualisée à 365 nm. Spectres de masse résultants du curcumin (en haut), de la déméthoxycurcumine (au milieu) et de la bisdéméthoxycurcumine (en bas).
Épuration éclair
Une méthode isocratique a été utilisée car la séparation montrée sur TLC était optimale telle quelle. Le matériau brut a été purifié sur une colonne de gel de silice sphérique de 25 g, 15 μm (PF-15SIHC-F0025). Un poids brut de 64 mg a été chargé à sec sur 500 mg de gel de silice et chargé dans une cartouche de charge sèche de 4 g (PF-DLE-F0004).
Figure 5: Chromatogramme flash résultant de la plaque TLC développée.
Identification des fractions par ASAP®/CMS
Le EXPression® CMS avec l'ASAP® La sonde d'analyse directe permet une identification facile des composés sans avoir besoin de LC/MS ou de préparation d'échantillon.
Les fractions pures (1.1, 1.3 et 1.5) ont été analysées à l'aide de l'ASAP® sonde avec ionisation APCI et polarité positive CMS. Les curcuminoïdes s'ionisent bien en polarité APCI positive et négative, cependant (M + H)+ les ions ont montré moins de fragmentation. Les masses détectées sont cohérentes avec les [M+H] théoriques+ valeurs m/z.
Figure 6: Advion Interchim Scientifique ASAP® La sonde d'analyse directe est insérée directement dans la source d'ions compatible APCI de l'exPression® CMS.
Figure 7: Spectres de masse des fractions.
Les fractions purifiées ont été concentrées à sec pour donner respectivement les solides I (14.1 mg), II (5.6 mg) et III (6.7 mg) qui représentent la curcumine (I), la déméthoxycurcumine (II) et la bisdéméthoxycurcumine (III) à 53.4%, 21.2 % et 25.3 % du profil curcuminoïde isolé. Ces résultats sont cohérents avec les valeurs rapportées dans la littérature2.
Confirmation de la pureté du composé par RP-HPLC
Figure 8: Balayage UV du mélange de fractions purifiées.
La chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) permet une confirmation séparée de la pureté du composé après la chromatographie flash. Un mélange égal des trois composés a été combiné et exécuté sur un Phenomenex Kinetex® 5 μm Colonne de biphényle 100 Å 50 x 2.1 mm utilisant ACN:eau isocratique (v:v, 55:45) avec 0.2 % d'acide formique. Comme prévu, l'ordre d'élution des trois curcuminoïdes a changé d'ordre avec maintenant l'élution III, II et I (Figure 8). Après avoir développé cette méthode, la fraction collectée unique respective a été injectée et analysée pour la pureté et à nouveau confirmée par analyse MS.
Figure 9: Balayage UV et spectre de masse de la fraction de curcumine 1.1.
Figure 10: Balayage UV et spectre de masse de la fraction de curcumine 1.3.
Figure 11: Balayage UV et spectre de masse de la fraction de curcumine 1.5.
Conclusion
Grâce à une combinaison de support de chromatographie TLC, de chromatographie flash et de spectrométrie de masse à différentes étapes du processus (identification de plaque TLC, confirmation de fraction et analyse de pureté secondaire), nous pouvons purifier les curcuminoïdes à partir de poudre de curcuma à des niveaux de pureté confirmés > 95 %.
Références:
1Jayaprakasha et al. Activités antioxydantes de la curcumine, de la déméthoxycurcumine et de la bisdéméthoxycurcumine. Chimie alimentaire, volume 98, numéro 4, 2006, pages 720-724. ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2Praveen et al. Approche RMN Facile pour le profilage des curcuminoïdes présents dans le curcuma, Food Chemistry, Volume 341, Part 2, 2021, 128646, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.128646.