Collecte de fractions dirigées vers la masse de produits naturels : exemples d'extraits de curcuma et de thé vert
Flash : purFlash® 5.250
Spéc. de masse : exPression® CMS
Échantillonnage : dès que possible® sonde
Introduction
La chromatographie flash utilise traditionnellement l'absorption UV comme principale méthode de détection des composés au cours d'un processus de purification. Alors que l'absorption UV est largement applicable à de nombreuses classes de composés, elle a une spécificité limitée aux composés individuels dans un mélange et manque des classes de composés qui ne portent pas de chromophores.
La collecte de fractions dirigée par la masse donne aux utilisateurs la possibilité de collecter des fractions basées sur la détection par spectrométrie de masse (MS) qui est basée sur des ions spécifiques à des composés individuels et fournit des informations moléculaires spécifiques. Cela permet une simplification du processus de purification global et une plus grande confiance dans l'identité de chaque composé isolé.
Nous décrivons ici des méthodes d'isolement de produits naturels à partir de thé vert et de poudre de curcuma par collecte de fractions dirigées vers la masse pendant la chromatographie flash et la LC préparative. À des fins de démonstration, les composés isolés ont ensuite été confirmés par Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP®) MS ou HPLC-MS.
Introduction aux curcuminoïdes
La curcumine est le principal curcuminoïde présent dans la racine de curcuma (Curcuma longa). Il est couramment utilisé comme ingrédient dans les compléments alimentaires et les cosmétiques, comme arôme dans les plats culinaires et comme colorant alimentaire jaune-orange. Les curcuminoïdes ont été signalés comme ayant des activités antioxydantes et anti-inflammatoires.
La poudre de curcuma achetée en magasin (57.3 g) a été extraite dans de l'éthanol, puis filtrée à travers du papier filtre et concentrée. Cela a donné une huile d'extrait brut de 6.4 g contenant les trois curcuminoïdes d'intérêt (comparer également l'analyse TLC à la figure 4).
Figure 1: Structures des curcuminoïdes d'intérêt.
Figure 2: Poudre de curcuma du commerce.
Figure 3: Extrait brut d'huile de poudre de curcuma.
Figure 4: Analyse CCM à 365 nm d'extrait de curcuma (97:3 DCM:MeOH) et le chromatogramme de la méthode transféré sur le puriFlash® 5.250 en utilisant la détection UV.
Développement de méthodes
L'extrait de curcuma a d'abord été analysé sur plaque TLC puis la méthode transférée sur le puriFlash® Système 5.250 utilisant la détection UV à deux longueurs d'onde. Quatre composés ont été détectés à 254 nm avec trois curcuminoïdes supposés détectés à 427 nm, cependant, il n'y a pas de spécificité pour les composés individuels dans la détection UV.
Une méthode isocratique (97:3 dichlorométhane:méthanol) a été utilisée car la séparation montrée sur TLC était optimale. Le matériau brut a été purifié sur une colonne de gel de silice sphérique de 12 g et 15 μm (PF-15SIHC-F0012). Un poids brut de 32 mg a été chargé à sec sur 250 mg de gel de silice et chargé dans une cartouche de charge sèche de 4 g (PF-DLE-F0004). Les fractions ont été recueillies à l'aide des canaux XIC pour chaque composé d'intérêt.
Figure 5: Capture d'écran de la méthode de chromatographie flash exécutée avec des paramètres.
Les paramètres du spectromètre de masse sont contrôlés via InterSoft®Logiciel X sur le puriFlash® système. Le spectromètre de masse était équipé d'une source APCI et fonctionnait en mode d'acquisition par ionisation négative.
Figure 6: Capture d'écran des paramètres du spectromètre de masse pour la chromatographie.
Expérience
Collecte de fractions dirigée en masse
Le chromatogramme ionique extrait (XIC) créé en traçant l'intensité du signal observé à une valeur masse-charge choisie. Cela permet un signal à faible bruit des composés d'intérêt. Ici, les canaux XIC sont réglés pour détecter les trois curcuminoïdes d'intérêt.
Figure 7: Analyse TLC de l'extrait de curcuma (97:3 DCM:MeOH) et chromatogramme de la méthode transférée sur le puriFlash® 5.250 en utilisant la détection MS XIC.
Figure 8: Les spectres de masse pour chaque pic tels que fournis par le puriFlash® Intersoft®Logiciel X.
au plus vite® Confirmation des fractions MS
Les fractions pures (1.1, 1.2 et combinées 1.3 et 1.4) ont également été analysées à l'aide d'ASAP® polarité négative SM. Les masses détectées sont cohérentes avec les valeurs [MH]-m/z théoriques.
Figure 9: Les spectres de masse des composés isolés confirmant leur identité et leur pureté.
Introduction, Catéchines de thé vert
Le thé vert sec se compose généralement de 10 à 30 % de polyphénols sur la base du poids sec, les catéchines étant les principaux polyphénols du thé, notamment : (−)-épigallocatéchine (EGC), (−)-épigallocatéchine-3-gallate (EGCG), (−) -épicatéchine-3-gallate (ECG) et gallate de (−)-gallocatéchine (GCG). L'EGCG est la catéchine la plus abondante et biologiquement active, séparer et purifier les catéchines de l'extrait de thé brut peut augmenter considérablement leur disponibilité et leur valeur sur le marché.
Les feuilles de thé vert sèches ont été extraites dans de l'eau chaude, puis partagées avec de l'acétate d'éthyle, filtrées sur du papier filtre et évaporées pour donner un extrait brut. L'extrait sec a ensuite été dissous dans 7.5 ml d'eau et filtré avec un filtre de 0.2 μm avant un traitement ultérieur.
Figure 10: Infusion de feuilles de thé vert.
Figure 11: catéchines majeures du thé vert.
Développement de méthodes
Avec l'analyse HPLC-UV/MS, EGC, EGCG, GCG, EC et ECG sont détectés dans l'extrait de thé (Figure 12).
Solvant A : eau
Solvant B : Méthanol
UV : 275 nm
MS : analyse complète de 150 à 900
Colonne : US15C18HP-250/046
Figure 12: Le chromatogramme HPLC-UV de l'extrait de thé vert, les données MS et un standard pour l'EGCG ont été utilisés pour la confirmation du composé (données non présentées).
Les paramètres du spectromètre de masse sont contrôlés via InterSoft®Logiciel X sur le puriFlash® système. Le spectromètre de masse était équipé d'une source ESI et fonctionnait en mode d'acquisition par ionisation négative.
Figure 13: Capture d'écran des paramètres du spectromètre de masse pour la chromatographie.
Collecte de fractions dirigée en masse
Ici, les canaux XIC sont réglés pour détecter les 4 catéchines d'intérêt. L'EGCG et le CGC sont des isomères et partagent donc la même masse.
Figure 14: Chromatogramme de la méthode transféré sur le puriFlash® 5.250 en utilisant la détection MS XIC.
Figure 15: Les spectres de masse pour chaque pic tels que fournis par InterSoft®Logiciel X.
Conclusion
• Avec l'isolement des produits naturels, l'un des plus grands défis est l'identification des composés d'intérêt dans les mélanges d'extraits complexes.
• En utilisant la SM et la chromatographie en tandem, nous pouvons séparer et identifier les composés dans un mélange complexe avec un haut degré de pureté et de précision sans avoir besoin d'une identification supplémentaire des fractions collectées.
• Les fractions collectées peuvent être caractérisées directement à travers les données MS fournies par InterSoft®Logiciel X sur le puriFlash® systèmes.
• Le puriFlash® 5.250 et exPression® CMS forme un duo puissant dans la purification et l'identification de produits naturels tels que les catéchines présentes dans le thé vert et les curcuminoïdes présents dans le curcuma.