Purification de peptides bioactifs à partir de mélanges complexes à l'aide du puriFlash® 5.250 PrepLC et exPression® Détecteur CMS
Instrumentation
Spécification de masse : exPression® CMS
Flash: puriFlash® 5.250 prépLC
HPLC : AVANT®
Auteur
Changtong Hao
Advion Interchim Scientifique
Introduction
Ces dernières années, les sociétés biopharmaceutiques ont de plus en plus adopté les médicaments à base de peptides/protéines en raison de leur spécificité et de leur sélectivité accrues par rapport aux médicaments traditionnels à petites molécules. Cependant, la purification des peptides/protéines au cours du processus de découverte de médicaments est cruciale pour garantir la sécurité et l'efficacité du produit final. Atteindre les niveaux de pureté les plus élevés possibles pour les composés cibles bioactifs est essentiel pour minimiser le risque de toxicité et se conformer aux normes réglementaires.
L'isolat de protéines de lactosérum, un sous-produit de la production de fromage, contient divers glycomacropeptides et deux peptides bioactifs importants, le macropeptide de caséine A (CMPa) avec un poids moléculaire (MW) de 6757 Da et le macropeptide de caséine B (CMPb) avec un MW de 6787 Da . Extraction et purification de composants individuels, tels que la caséine
macropeptide, est essentiel pour étudier leur bioactivité.
Dans cette note d'application, nous utilisons un isolat de protéines de lactosérum et deux macropeptides de caséine comme exemple pour démontrer l'isolement et la purification de composants bioactifs avec un système composé d'un puriFlash® 5.250 prepLC couplé en ligne à un exPression® Détecteur CMS. Cette combinaison offre une sélectivité et une sensibilité plus élevées par rapport aux détecteurs traditionnels tels que les UV ou l'ELSD, qui peuvent ne pas répondre efficacement aux peptides et protéines cibles bioactifs.
Advion Interchim Scientifique
puriFlash® 5.250
Advion Interchim Scientifique
exPression® CMS
Method
Préparation de l'isolat de protéines de lactosérum
• La procédure d'isolement des macropeptides de caséine utilisée dans cette application est basée sur les travaux de Tadao Saito avec quelques modifications.
• Un échantillon de 50 g d'isolat de protéines de lactosérum acheté dans une épicerie locale a été combiné avec 500 ml d'un mélange de solvants composé de 70 % d'eau et de 30 % de méthanol (v/v). Le mélange a été soniqué à 70°C pendant 90 minutes puis filtré sous pression réduite.
• Le filtrat résultant a été concentré à un volume de 300 ml en éliminant le méthanol à l'aide d'un évaporateur rotatif sous pression réduite à 40 °C. Il a ensuite été stocké à 4°C pendant une heure. Ensuite, un volume égal d'éthanol froid a été ajouté à la solution, et le mélange a été vortexé pendant 5 minutes avant d'être stocké à 4°C pendant 4 heures supplémentaires.
• Le mélange a été filtré sous pression réduite à l'aide d'un filtre de 0.5 µm. Le filtrat final a ensuite été concentré jusqu'à un volume de 50 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif sous pression réduite.
• Une aliquote de 100 μL de l'extrait concentré a été mélangée à 900 μL de solution déionisée (DI)
l'eau pour l'analyse HPLC/MS analytique.
• Le filtrat restant a été utilisé pour la purification des peptides à l'aide du puriFlash® 5.250 Système PrepLC couplé à un exPression® Détecteur CMS.
Tableau 1: Configuration de la méthode analytique HPLC/MS
Configuration de la méthode analytique HPLC/MS
L'extrait liquide de l'isolat de protéines de lactosérum a d'abord été analysé à l'aide d'un AVANT® Système HPLC/CMS et méthode de séparation par chromatographie développée pour la colonne de 4.6 mm utilisée (tableau 1).
La figure 1a montre le chromatogramme HPLC/MS de l'extrait liquide. La moyenne des spectres MS à partir du pic à 6.44 min indique que le composé est un peptide chargé plusieurs fois avec au moins cinq masses à m / z 755.2, 849.4, 970.6, 1132.1 et 1358.6 (Figure 1b) formant un profil de charge.
Grâce à la déconvolution de charge logicielle, la masse non chargée du peptide a été déterminée comme étant de 6787.4 Da, indiquant le macropeptide B de caséine (CMPb, masse théorique de 6787 Da) (Figure 1c).
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AVANT® (U) HPLC
Figure 1: ( a ) Chromatogramme HPLC / MS d'extrait liquide d'isolat de protéine de lactosérum, ( b ) Les spectres MS moyens du pic à RT 6.44 min, ( c ) La masse déconvoluée et non chargée du pic d'élution du peptide à RT 6.44 min.
Figure 2: ( a ) Chromatogramme HPLC / MS d'extrait liquide d'isolat de protéines de lactosérum, ( b ) Les spectres MS moyens du pic à RT 11.02 min, ( c ) La masse déconvoluée et non chargée du peptide éluant à RT 11.02 min.
Les spectres MS moyens obtenus à partir du pic d'élution à 11.02 min suggèrent que le composé est également un peptide chargé plusieurs fois avec des masses à m/z 751.5, 845.4, 966.1, 1126.8 et 1352.1 (figure 2b) formant son profil de charge.
De même, la déconvolution de charge détermine la masse non chargée de ce peptide à 6755.3 Da indiquant la variante A du macropeptide de caséine, CMPa avec une masse théorique de 6755 Da (Figure 2c).
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puriFlash® 5.250, séparateur MS et exPression® CMS
Chromatographie PrepLC/MS
Dans une étape suivante, la méthode de séparation analytique a été transposée à une plus grande échelle de préparation d'un ID de colonne de 4.6 mm à un ID de colonne de 30 mm et optimisée pour la purification des deux CMP (glyco-macropeptides de caséine) sur le puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash couplé en ligne à l'exPression® Détecteur CMS.
Le chromatogramme PrepLC-UV/MS de l'isolat de protéines de lactosérum est illustré à la figure 3 et les paramètres indiqués au tableau 2.
La collecte de fractions a été déclenchée sur la base du signal MS, choisi pour sa sélectivité et sa sensibilité plus élevées. XIC de 970-971 Da a été utilisé pour détecter CMPb, et XIC de 965-966 Da pour CMPa.
Le solvant organique de la combinaison des fractions 11 à 17 et de la fraction 18 à 22 a été éliminé à l'aide d'un évaporateur rotatif sous pression négative, et la solution aqueuse restante
La solution a été séchée à l'aide d'un lyophilisateur LABCONCO Freezone 2.5 L (-50 C), ce qui a donné une collection sèche de 10 mg chacun, qui a ensuite été dissoute dans 10 ml d'eau désionisée pour une analyse HPLC/UV/MS ultérieure. Les résultats de l'analyse de pureté sont présentés dans les figures 4 et 6.
Tableau 2: Configuration de la méthode PrepLC/MS
Figure 3: Le chromatogramme PrepLC-UV/MS de deux isolats de protéines de lactosérum
Résultats
Analyse de pureté du CMPb
L'analyse de pureté de CMPb dans les fractions regroupées 11 à 17 est illustrée à la figure 4. L'analyse MS montre que quatre ions majeurs ont été détectés avec m/z à 970.8, 1132.3, 1358.6 et 1968.2 (figure 4b).
Avec les spectres de masse moyens de la figure 4b, la masse non chargée du pic à 5.94 min a été déterminée comme étant de 6788.4 (CMPb, figure 4c). Cependant, l'analyse MS peut également détecter quatre composants mineurs à 6758.3, 6773.5, 6804.8 et 6868.4 Da.
La pureté UV obtenue de CMPb est de 86.7 % (figure 4d), mais, sur la base des données MS supplémentaires, la pureté du composé est en fait inférieure à celle (estimée à 80 %).
Le CMPa dans les fractions regroupées 18 à 22 a été mesuré à 94.7 % (figure 5a) sur la base de l'analyse UV de l'analyse.
L'analyse de masse non chargée déconvoluée montre la masse dominante attendue de 6756.2 de CMPa (figure 5b) et un composant mineur à 6774.6, une forme oxydée de CMPa.
Encore une fois, cet exemple montre la valeur de la détection MS de composés bioactifs tels que les peptides et les protéines, et la meilleure spécificité de la détection MS par rapport aux UV.
Figure 4: (a) Le chromatogramme HPLC-MS des fractions regroupées de 11 à 17, (b) Moyenne des spectres MS du pic éluant à RT 5.94 min, (c) la masse non chargée de (b), (d) Le chromatogramme HPLCUV des fractions regroupées du 11 au 17.
Figure 5: ( a ) Le chromatogramme HPLC-UV des fractions regroupées de 18-22. (b) masse non chargée déconvoluée de CMPa.
La pureté globale finale est estimée à env. 90 %, une excellente valeur pour une molécule bioactive dans la découverte de médicaments.
Une amélioration supplémentaire de la pureté peut être obtenue avec des fractions sélectives - au détriment du rendement. Par exemple, l'analyse HPLC-UV/MS de la fraction 20 de CMPa (Figure 6a) montre une pureté UV de 99.0 % (Figure 6d) et aucun sous-produit oxydé dans l'analyse MS.
Figure 6: ( a ) Le chromatogramme HPLC-MS de la fraction 20, ( b ) Moyenne des spectres MS du pic à RT 5.71 min, ( c ) masse non chargée déconvoluée de CMPa ( d ) Le chromatogramme HPLCUV des fractions 20.
Conclusion
Le puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash, couplé en ligne avec un exPression® Le détecteur CMS atteint des performances exceptionnelles, facilitant la purification sélective de macropeptides bioactifs à partir d'une matrice complexe avec un niveau de confiance élevé. Comparé aux détecteurs UV ou ELSD, le spectromètre de masse offre une sélectivité et une sensibilité supérieures.
Une application illustrative de cette approche montre l'isolement de caséine glycol-macro-peptides, résultant en une gamme de pureté de 80% (CMPb) à 90% (CMPa) à travers des fractions combinées avec un rendement élevé. Une pureté encore plus élevée allant jusqu'à 99.0 % peut être obtenue avec des fractions sélectives.
Références
Gräslund, S., et al. (2008). Production et purification de protéines. Méthodes naturelles, 5(2), 135-146.
Traitement biopharmaceutique : développement, conception et mise en œuvre de procédés de fabrication.
Lin T., et al. (2021) Bioactifs dans le lait de vache : chimie, technologie et applications Nutrition Reviews v79(S2):48–69
Saito T., euh al. (1991) Une nouvelle méthode d'isolement de caséinoglycopeptide à partir de lactosérum de fromage doux. J. Dairy Sci. 74, 2831-2837