Introduction

L'amélioration des techniques analytiques et des outils méthodologiques joue un rôle important dans la caractérisation et l'isolement des métabolites secondaires bioactifs dans la recherche sur les produits naturels. La chromatographie liquide en phase inverse-spectrométrie de masse (RP-LC-MS) est largement utilisée pour le profilage des métabolites d'extraits naturels complexes au niveau analytique et est de plus en plus utilisée pour l'isolement ciblé de biomarqueurs par MS. La chromatographie en phase normale (NP-LC) est bien adaptée à la purification des métabolites secondaires polaires offrant également certains avantages par rapport à la RP, tels que les faibles pressions de fonctionnement et les phases stationnaires les moins chères.

Cependant, NP-LC n'est généralement pas bien adapté au couplage MS. Le potentiel de NP-LC-APCI-MS pour la purification de métabolites à l'échelle préparative en utilisant des méthodes de séparation génériques a été étudié sur un Advion X Interchim PuriFlash® - Système CMS compte tenu de son application pour l'isolement ciblé par la SEP d'un métabolite secondaire lipophile. Un mélange de trois produits naturels apolaires représentatifs a été utilisé pour optimiser la séparation, la division et l'ionisation MS dans des conditions imitant des cas d'isolement réels. Enfin, une isolation réussie des constituants apolaires de l'extrait de racines de dichlorométhane d'Angelica archangelica a été réalisée.

Isolement rapide d'un mélange de produits naturels apolaires représentatifs par Flash-CMS en phase normale

Purification d'un mélange de produits naturels sur des colonnes flash en phase normale de 12 g et 25 g

Trois normes disponibles dans le commerce (oxyde de caryophyllène, khelline et alpha-santonine) ont été utilisées pour évaluer l'applicabilité du système puriFlash-CMS en tant qu'outil de purification rapide des composés lipophiles à partir d'extraits de plantes brutes.

Les quatre chromatogrammes montrent le profil du mélange à l'échelle préparative avec des gradients rapides sur deux tailles de colonnes avec un bon chevauchement des signaux UV et MS.

Tous les paramètres ont été soigneusement optimisés pour la séparation et la détection. Un soin particulier a été pris pour trouver des conditions d'ionisation et de division qui permettraient une bonne détection et

Purification guidée par Flash-MS d'un composé donné

Schéma de la dilution de la pompe de maquillage post-colonne

Système puriFlash-CMS

Les solvants de la phase normale sont hautement inflammables pour la source APCI et doivent être évités en raison du processus de chauffage.

Une dilution post-colonne optimisée était obligatoire afin d'avoir une ionisation efficace et sûre. Le mélange de solvants lorsqu'il a atteint le détecteur MS était à> 99% soit ACN soit MeOH.

La détection APCI-MS avec des conditions de division optimisées et une élution post-colonne du solvant approprié s'est avérée robuste et bien adaptée à ce type de purification.

PuriFlash-CMS en phase normale de purification d'extrait de racines d'Angelica archangelica

HPLC-UV analytique

Échelle analytique:

Échelle préparative:

Flash préparatif UV-ELSD-MS

Les racines d'Angelica archangelica sont riches en dérivés de la coumarine. La détection MS-ELSD en plus de la détection UV a permis la surveillance des métabolites secondaires sans chromophores ou faibles et la sélectivité de la MS a été d'une grande aide pour une collection précise de composés partiellement coéluants.

Conclusion

La purification flash en phase normale représente une stratégie efficace pour un isolement rationnel de biomarqueurs lipophiles spécifiques ou de composés bioactifs sur la base des résultats du profilage des métabolites. Le fractionnement déclenché par MS et la surveillance ELSD en plus de la détection UV standard est un outil puissant pour une collecte précise et pour estimer la quantité de composés séparés. MS est particulièrement utile pour la collecte spécifique de tout m / z en cas de coélution qui se produit souvent dans les extraits bruts en utilisant des méthodologies chromatographiques à charge élevée et à faible capacité de crête.

Cette approche rapide et rationnelle peut être largement utilisée pour les purifications en une seule étape et l'isolement de mélanges synthétiques et naturels. Il est également compatible pour la détection de composés apolaires dépourvus de chromophores, ce qui est très courant dans la recherche sur les produits naturels. La séparation effectuée à l'échelle préparative permet de purifier des dizaines à des centaines de mg de composés pour une identification structurelle plus poussée et une évaluation de leurs bioactivités.

Bibliographie

David Rigi¹, Antonio Azzollini¹Et Emerson Ferreira Queiroz¹, Jean-Luc Wolfender¹
Ecole des sciences pharmaceutiques, Université de Genève, Université de Lausanne, 30 Quai Ernest-Ansermet, 1211 Genève 4, Suisse
[1] Davy Guillarme, Dao TT Nguyen, Serge Rudaz, Jean-Luc Veuthey, Eur. J. Pharma. Biopharma. 2008, 68, 430

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