L'extraction, l'identification, la purification et la quantification du cyanidine-3-glucoside dans le riz noir
Instrumentation
Flash: puriFlash® 5.250, XS-Vap®
Spécification de masse : exPression® Spectromètre de masse compact (CMS)
HPLC : AVANTMC
Introduction
Le riz est l'un des aliments les plus essentiels au monde, en particulier dans les pays asiatiques. Parmi les variétés de riz pigmentées, le riz noir fait l'objet d'une attention croissante en raison de sa haute valeur nutritive et de ses propriétés bénéfiques pour la santé. Le riz noir est un riz pigmenté enrichi en anthocyanes qui contient de la cyanidine-3-glucoside (Cyn-3-Glu), de la cyanidine-3-rutinoside (Cyn-3-Rut), de la péonidine-3-glucoside (Pn-3-Glu) et d'autres anthocyanes. Le cyanidine-3-glucoside est l'anthocyanine dominante du riz noir.
Cette note d'application montre comment le cyanidine-3-glucoside est extrait du riz noir et purifié avec un système prepLC/Flash. La quantité et la pureté de Cyn-3-Glu sont mesurées à l'aide d'un étalon de référence certifié.
Method
Extraction de cyanidine-3-glucoside
Le riz noir a été acheté dans une épicerie locale, broyé en poudre fine avec un moulin à épices et extrait selon la méthode suivante :
1. 30 grammes de riz noir moulu ont été mélangés avec 200 ml de méthanol acidifié avec du HCl 1.0 N (85:15, v/v) et soniqués pendant 15 min.
2. Le mélange a été centrifugé à 7500 rpm à 4°C pendant 5 min. Le surnageant a été transvasé dans un flacon propre. Le culot a été extrait à nouveau avec 200 ml de méthanol acidifié avec du HCl 1.0 N (85:15, v/v) et soniqué pendant 15 min.
3. Le surnageant des deux extractions a été combiné et réduit à 25 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif.
4. Une petite partie de l'extrait concentré a été diluée 10x avec de l'eau pour l'analyse HPLC/UV/MS, le reste a été chargé directement sur un système PrepLC/Flash pour la purification.
Configuration analytique HPLC/UV/MS
Tableau 1: Méthode analytique HPLC/UV/MS pour l'extrait de riz noir.
Analyse HPLC/MS analytique de l'extrait de riz noir
L'extrait concentré de riz noir a été dilué 10x avec de l'eau distillée pour l'analyse HPLC/CMS.
Avec une plage de masse de 200 à 800 Da, le chromatogramme HPLC/MS est illustré à la figure 1a. Le spectre MS moyen à partir du pic à 12.10 min est illustré à la figure 1b avec un seul ion à m / z 449.2 détecté en mode ESI positif. Le spectre MS avec CID dans la source est illustré à la figure 1c montrant un ion fragment de confirmation à m / z 287.0
Figure 1: UN). Le chromatogramme HPLC/MS d'extrait de riz noir, B). Les spectres de masse moyens de pic à 12.10 min, C). Les spectres de masse moyens du pic à 12.10 min avec CID en source à 30V.
Recherche dans la base de données MS Spectra
Grâce à la recherche dans la base de données des spectres MS dans Advion Data Express, le composé élué à 12.1 min est confirmé comme cyanidine-3-glucoside (Cyn-3-Glu).
Figure 2: Résultat de la recherche dans la bibliothèque des spectres MS moyens dans l'extrait de la figure 1c.
Le logiciel Peak Express aide à détecter d'autres anthocyanes
Le logiciel Peak Express™ implémenté dans Data Express peut déterminer dynamiquement le taux de changement d'intensité et l'écart type de tous les ions détectés et n'afficher que les ions qui dépassent un seuil prédéfini.
Peak Express™ aide à détecter un autre pic à 14.41 min dans le chromatogramme ΔIC (Figure 3b) qui est à peine indiqué dans son chromatogramme TIC (Figure 3a). Le spectre ΔS Delta avec le CID dans la source montre deux ions détectés à m/z 463.3 et 301.1.
La recherche dans la base de données du spectre MS détermine qu'il s'agit de Peonidine-3-O-glucoside (le résultat de la recherche est illustré à la figure 4).
Figure 3: UN). Le chromatogramme HPLC/MS de l'extrait de riz noir, B). Le chromatogramme ΔIC de l'extrait de riz noir C). Le spectre ΔS Delta du pic à 14.41 min avec CID en source à 30 V
Figure 4: Le résultat de la recherche de bibliothèque du spectre ΔS Delta dans la figure 3c
Analyse HPLC/UV de l'extrait de riz noir
L'extrait de riz noir a également été analysé par HPLC/UV. Deux pics d'absorption UV caractéristiques de Cyn-3-Glu à 12.01 min se trouvent à 278 nm et 518 nm (figure 5b).
520 nm est utilisé pour déclencher la collecte de fractions dans la purification avec un système PrepLC/Flash.
Figure 5: UN). Le chromatogramme HPLC/UV de l'extrait de riz noir, B). Le profil d'absorbance UV à partir du pic à 12.07 min
Méthode PrepLC pour la purification du cyn-3-glu
Tableau 2: Méthode PrepLC pour la purification de Cyn-3-Glu
Purification
Les purifications d'extrait de riz noir sont effectuées sur un Advion Interchim Scientific puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash.
Les informations détaillées sur les solvants et la méthode de séparation sont répertoriées dans le tableau des méthodes. Le chromatogramme PrepLC/UV typique de l'extrait de riz noir (échantillon de 3 ml) est illustré à la figure 6.
Chaque fraction collectée est en outre analysée par HPLC-UV/MS pour confirmer l'identification et fournir une analyse de pureté supplémentaire.
Figure 6: Le chromatogramme prepLC (520 nm) de l'extrait de riz noir sur puriFlash® 5.250 Système PrepLC/Flash
Analyse HPLC/UV des fractions 2, 5 et 8
Toutes les fractions sont analysées par HPLC/UV/MS. L'analyse HPLC/MS de la fraction 1 montre une impureté avec le m/z 611, et une faible réponse UV de Cyn-3-Glu. Et les fractions 2 à 8 ont une pureté de plus de 97.6 %. Les chromatogrammes HPLC/UV des fractions 2, 5 et 8 sont utilisés comme exemples illustrés à la figure 7 avec des puretés de 97.6 % pour 2, 100 % pour les fractions 5 et 8.
À l'exception de la première fraction, toutes les fractions ont été combinées pour la siccité. Le séchage des fractions a été réalisé sur un Advion Interchim Scientific puriFlash® Système XS-Vap à température ambiante. Le poids de Cyn-3-Glu purifié à partir de 30 g de riz noir est de 25.8 mg.
Figure 7: Le chromatogramme HPLC/UV des fractions a) Fraction 2, b) Fraction 5, c) Fraction 8.
Quantification du C3G par HPLC/UV
Pour confirmer la pureté finale de l'échantillon séché, un étalon de référence certifié de Cyn-3-Glu a été utilisé pour l'analyse quantitative de Cyn-3-Glu sec afin de vérifier sa pureté. La courbe d'étalonnage HPLC de la référence Cyn-3-Glu est illustrée à la figure 8.
La quantité mesurée de Cyn-3-Glu est de 25.5 mg avec une pureté de 99.0 %.
Figure 8: Courbe d'étalonnage HPLC/UV de l'étalon de référence Cyn-3-Glu
Conclusion
Avec les méthodes HPLC/UV/MS et PrepLC développées, le Cyn-3-Glu dans l'extrait de riz noir peut être séparé, purifié et quantifié.
25.5 mg de Cyn-3-Glu ont été purifiés à partir de 30 g de riz noir avec une pureté de 99.0 %.
La combinaison d'Interchim PrepLC/Flash et d'Advion HPLC-UV/CMS est une solution simple et économique pour extraire et purifier le Cyn-3-Glu à partir d'échantillons de riz ou d'échantillons contenant du Cyn-3-Glu.
Suite à ce flux de travail général :
HPLC/CMS fournit un moyen simple pour l'identification et l'analyse de la pureté des composés cibles dans la purification de produits naturels.