セットアップ
質量分析：ex expression CMS^® コンパクト質量分析計（CMS）
HPLC: アバント^®

イントロダクション

オリゴヌクレオチドは、その利点によりバイオ医薬品開発において大きな注目を集めています。
遺伝子またはタンパク質の発現を調節する能力。 彼らの臨床的成功は、いくつかのオリゴヌクレオチドベースの医薬品の承認または臨床試験への進出によって明らかです。^【1] これらの薬剤には、アンチセンス オリゴヌクレオチド、低分子干渉 RNA (siRNA) 治療薬、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) ワクチンの開発成功に代表される mRNA ベースのワクチンなどが含まれます。 このような成果により、オリゴヌクレオチドの研究開発へのさらなる関心と投資が促進されました。

固相合成は、オリゴヌクレオチド配列を生成するために一般的に使用される方法です。 原料は通常、所望の純度レベルに応じて、脱塩、限外濾過、固相抽出 (SPE)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、分取液体クロマトグラフィー (prepLC) などのさまざまな技術を通じて精製されます。 イオンペアリング HPLC または分取 LC メソッドは、他の技術と比較して純度が高いため、多くの場合好まれます。

このアプリケーション ノートは、複数のオリゴ サンプルの HPLC/UV 分析を実証し、HPLC/CMS 分析を利用してそれらの分子量を決定することを目的としています。

方法

HPLC-UV/CMSシステム
クォータナリポンプとカラム選択バルブを使用すると、さまざまな分析で異なるバッファーとカラムを切り替えるプロセスが非常に簡単になり、手動での操作が不要になります。
カラムを取り外して溶媒を交換します。 この自動化により、分析プロセスの効率と利便性が大幅に向上します。

オリゴ(dT) 12-18 プライマー
Oligo(dT) 12-18 プライマー (Thermos Fisher Scientific、MA) を使用して、オリゴヌクレオチド分析の HPLC 法をチェックしました。

これらのオリゴ(dT) 12-18 プライマーの分離は、Interchim Uptisphere Strategy 5 μm C18HQ カラム 250 x 4.6 mm を使用したイオンペア逆相 HPLC 法を使用して実行されました。 すべての分析で 10 μL アリコートを注入し、カラム温度を 30℃ に維持しました。 移動相 A の組成は 100 mM TEAA 水溶液で、移動相 B はアセトニトリルです。 流量は1ml/minです。

HPLC 分析は次のように進められました。サンプルの注入後、移動相 B を 10 分間 1% に設定しました。 その後、15 分間にわたって 24% まで直線的に増加しました。 25.1 分で、95% に増加し、このレベルを 2.4 分間維持してカラムを洗浄しました。 その後、27.6 分で 10% に低下し、カラム平衡化のために 2.4 分間維持しました。

図 1 は、HPLC メソッドが 12 つの Oligo(dT) 18 ～ XNUMX プライマーを効果的に分離することを示しています。

4 つのコンポーネントを含む RNA スタンダード
ＲＮＡオリゴヌクレオチド混合物（Ａｇｌｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を、ＨＰＬＣ分析の前にＤＩ水で１０倍に希釈することによって調製した。 10 つの RNA 標準の配列は次のとおりです: 14 mer (CACUGAAUACCAAU)、17 mer (UCACACUGAAUACCAAU)、20 mer (UCAUCACACUGAAUACCAAU)、および 21 mer (GUCUCAUCACACUGAAUACCAAU)。

これらの RNA サンプルの分離は、オリゴ (dT)12-18 プライマーの場合と同様の HPLC 方法をわずかに変更して使用して実行されました。

HPLC 分析は次のように進められました。サンプルの注入後、移動相 B を 9 分間 1% に設定しました。 その後、10 分間にわたって 24% まで直線的に増加しました。 25.1 分で、95% に増加し、このレベルを 2.4 分間維持してカラムを洗浄しました。 その後、27.6 分で 9% に低下し、カラム平衡化のために 2.4 分間維持しました。

図 2 は、1 mer RNA サンプルと 20 mer RNA サンプルの間に 21 mer の違いがある場合でも、HPLC メソッドが 20 つの RNA サンプルを効果的に分離することを示しています。 合成中のほとんどの不純物は通常 N=21 mer または N+1 mer であるため、1 mer と XNUMX mer のこのベースライン分離は合成オリゴヌクレオチドの分析にとって重要です。^【2]

ssDNA サンプル
17 mer (GTCAGCAAGGACATCGT)、18 mer(CATTTGAGTAGCCAACGC)、および 19 mer (GGACACTTTCATGCGAGTT) の XNUMX つの一本鎖 DNA サンプル (ssDNA) も、RNA サンプルに使用したものを修正した HPLC 方法を使用してテストされました。

各 ssDNA の濃度は 30 μM で、10 μL のアリコートを分析のためにカラムにロードしました。 HPLC 分析は以下の勾配を使用して実行されました。サンプル注入後、移動相 B (MPB) を 9 分間 1% に設定し、その後 15 分間かけて 24% まで直線的に増加しました。 25.1 分で、95% に増加し、このレベルを 2.4 分間維持してカラムを洗浄しました。 27.6 分で MPB は 9% に減少し、カラム平衡化のためにこのレベルを 2.4 分間維持しました。 分析の流量は 1.5 ml/min に設定されました。 RNA サンプルと比較して溶媒 B の 3 分あたりの変化が大きいにもかかわらず、図 XNUMX は、このメソッドが良好なベースライン分解能で XNUMX つの ssDNA サンプルを効果的に分離していることを示しています。

ssDNA サンプルの純度分析
図 3 に示す ssDNA サンプルに使用したのと同じ方法で、ssDNA サンプルの純度分析にも使用しました: 19 mer (5'-TGGCGGGCGTACCTGGACT-3')。

図 4 は、Advion Data Express ソフトウェアを使用して測定した 19 mer ssDNA 4 の 74.3 nm での UV 純度が 260% であることを示しています。

F.5 純度分析に使用される ssDNA サンプルの MS 分析
オリゴヌクレオチドの HPLC/MS 分析は、Advion AVANT を使用して実行されました。^® Advion Ex と組み合わせた HPLC システム expression CMS^® CMS-L。 MS 分析には、寸法 2.6 x 18 mm の Interchim Uptisphere Strategy 50 μm C2.1-HQ カラムを流速 0.2 ml/分で使用しました。 カラム温度は55℃に設定した。

オリゴヌクレオチドの質量分析に TEAA を使用する場合と比較して、TEA と HFIP を組み合わせたイオンペア試薬は性能が大幅に向上します。 したがって、このアプリケーション ノートでは、オリゴヌクレオチドの HPLC/MS 分析に TEA および HFIP イオンペア試薬を使用することに焦点を当てます。

移動相は、移動相 A として 15 mM TEA および 10 mM HFIP 水溶液、および移動相 B としてメタノールから構成されました。合計 HPLC 実行時間は 25 分で、5% の溶媒 B で 1 分間開始しました。
次に、B のパーセンテージは 6 分間で 14% まで増加し、続いて 95 分で 15.1% まで増加し、目的の化合物を溶出するために 2.9 分間維持されました。 続いて、%B を 5% に減らし、次の分析の前にカラムを平衡化するために 6.9 分間このレベルに維持しました。

MS 分析は、MS スキャン範囲を 500 ～ 2000 Da に設定してネガティブ ESI モードで実施しました。 図 5b は ssDNA-4 の MS スペクトルを示しており、m/z 1463.9 (4-)、1170.8 (5-)、(975.8 (6-)、936.0 (7-)、731.8 (8-) にピークを持つ荷電エンベロープを示しています) Data Express での電荷デコンボリューションにより、ssDNA サンプルの非電荷質量は 650.2 Da と決定され、これは理論値 9 Da とほぼ一致します。

さらなるサンプル例の MS 分析
ssDNA-5 (5'-GGG-TGG-CAT-TATGCT-GAG-T-3') の MS スペクトルを図 6 に示します。これは、m/z 1477.8(4-)、1182.1() にピークを持つ荷電エンベロープを示しています。 5-)、984.7(6-)、843.8(7-)、738.2(8-)。 電荷デコンボリューションにより、ssDNA-5 の非電荷質量は 5913.9 であると決定されました。これは、理論値 5914.9 とほぼ一致しています。

結論

TEAA (酢酸トリエチルアンモニウム) イオン対試薬と組み合わせた粒子サイズ 5 μm の C18HQ カラムの使用は、オリゴヌクレオチド HPLC 分析に適したソリューションであることが実証されています。

オリゴヌクレオチドの MS 分析では、AVANT と組み合わせて、イオンペアリング試薬として HFIP (ヘキサフルオロイソプロパノール) および TEA (トリエチルアミン) を使用した同じ C18HQ カラムを使用できます。^® HPLC-UV/CMSシステム。 この方法は、オリゴヌクレオチドの追加の正確な質量測定をもたらすことが証明されています。

全体的には、Interchim C18HQ カラムと適切なイオンペア試薬を AVANT と組み合わせて利用します。^® HPLC-UV および HPLC-CMS システムは、オリゴヌクレオチドの純度分析および特性評価のための信頼できるソリューションを提供します。

参考情報
^【1]Roberts, TC、Langer, R. & Wood, MJA オリゴヌクレオチドドラッグデリバリーの進歩。 Nat Rev Drug Discov 2020、19、673–694
^【2]マルチナ C. 他オリゴヌクレオチド: 合成、特性評価、および精製における最新の傾向と革新的なアプリケーション、バイオテクノロジー J. 2020、1900226

イントロダクション

イオヘキソールは、X 線分析のコントラストを向上させる、広く使用されている非イオン性造影剤です。 その低い浸透圧は、腎臓を介した迅速なクリアランスを可能にし、再吸収とさらなる代謝を防ぎます^【1]. これにより、イオヘキソールは他の造影剤と比較して安全性プロファイルが優れた化合物になります^【2]. 

多くの臨床イメージング アプリケーションでは、造影剤/造影剤が患者に投与され、スキャンのコントラストと空間分解能が向上します。 造影剤の毒性と副作用のため、安全な使用と正確な診断のために、既知の濃度で調製し、純度を分析することが非常に重要です。 

このアプリケーション ノートでは、イオヘキソール分析のためのシンプルで正確な HPLC-CMS メソッドを紹介します。

方法

メソッドのセットアップ

アプリケーションで使用したすべての溶媒は HPLC グレードでした。

Sigma Aldrich から XNUMX つのイオヘキソール標準を入手しました。

99.99 つは純度 95% の認定標準物質で、もう XNUMX つは純度が XNUMX% 以上でした。

すべての実験は Advion Interchim Scientific で実行されました。^® ex expression CMS^® AVANT と組み合わせたコンパクトな質量分析計^® 表 1 に示すパラメーターを備えた UHPLC システム。

テーブル1: HPLC/MS法

イオヘキソールのHPLC/UV/MS分析

室温では、イオヘキソールは HPLC/UV/MS 分析で検出された XNUMX つのピークで異性化します。 

これらの 1 つのピーク (図 XNUMXA) は、イオヘキソールの中央のベンゼン環に結合したかさばるヨウ素原子によるアニリド N-アセチル基の妨害された回転に由来します。 これらの XNUMX つの化合物は本質的に「回転異性体」であり、水溶液中で室温でゆっくりと入れ替わります。

両方のピークは、821.9 で同じ m/z を示す MS 分析で確認され (図 1B および 1C)、インソース CID 質量スペクトルに違いは見られませんでした (図 2A および 2B)。 

両方の回転異性体は、X 線分析における化合物の毒性とイメージング能力の向上に寄与するため、このアプリケーション ノートでは、両方のピークの合計を以降のイオヘキソール分析に使用します。 

図1: (A) イオヘキソールの HPLC クロマトグラム (254 nm)、(B) m/z 821.8 でのプロトン化イオヘキソールの抽出イオン クロマトグラム、(C) RT 4.06 分でのピークからの平均 MS スペクトル。

図2: (A) RT 3.61 分でのピークからの平均インソース CID 質量スペクトル、(B) RT 4.06 分でのピークからの平均インソース CID 質量スペクトル。

HPLC/UV分析による純度測定

イオヘキソール サンプルの HPLC レスポンスを、同様の濃度のイオヘキソール認定標準のレスポンスと比較することにより、サンプルと認定標準のピーク面積比から、濃度と純度を迅速に分析できます。 

イオヘキソールの濃度比を計算する式を以下に示します。

イオヘキソール サンプルと認定参照の HPLC クロマトグラムを図 3A と 3B に示します。

合計された 714 つのピーク面積の平均値は、イオヘキソール サンプルでは 3 (図 740A)、イオヘキソール参照標準では 3 (図 0.0964B) です。 濃度比の計算では、サンプル中のイオヘキソールの計算濃度は 96.4 mg/ml であり、これは 95% の純度に相当します。

図3: (A) イオヘキソール サンプル (254 mg/ml) の HPLC クロマトグラム (0.1 nm) (B) イオヘキソール参照標準 (254 mg/ml) の HPLC クロマトグラム (0.1 nm)。

HPLC/UV分析による定量

イオヘキソールサンプルの純度をより正確に確認するために、25 ～ 500 μg/mL の 0.9999 つの異なる希釈レベルと各濃度で 4 回の注入を使用して、イオヘキソール認定標準物質の検量線を作成しました。 得られた線形キャリブレーション関数の R 二乗値は XNUMX (図 XNUMX) で、優れた直線性を示しています。 

イオヘキソール キャリブレーション カーブ アプローチにより、イオヘキソール サンプルの純度は 97.5% であると決定されました。 

この値は、サンプルの最低 95% の記載された純度のすぐ上でもあり、イオヘキソール サンプルとイオヘキソール参照標準の直接 UV 応答比分析による測定値とはわずか 1.1% しか異なりません。

認定された参照標準物質が利用できる場合、校正機能または直接 UV 応答比分析による純度決定の両方を、UV 吸光度のある有機化学物質に使用できます。

キャリブレーション関数法は、より正確な測定を提供します。

図4：HPLCクロマトグラム（254 nm）によるイオヘキソールの検量線

結論

Advion Interchim Scientific AVANT^® (U) HPLC システムは、イオヘキソールで示されているように、造影剤の純度分析のための正確なクロマトグラフィー方法を提供できます。 UHPLC と Advion Interchim Scientific ex の組み合わせ expression CMS^® コンパクト質量分析計は、ターゲット化合物の質量と質量による確認を提供するだけでなく、 インソースのフラグメンテーションパターンだけでなく、不純物の迅速な測定も可能にします。 

参考文献
^【1] T. Almen、非イオン性造影剤の開発、Invest. ラジオル。 (1985) 調査放射線学。 1985、20(1)、S2-S9。
^【2] RD Moore、EP Steinberg、NR Powe、RI White、JA Brinker、EK Fishman、SJ Zinreich、CR Smith、高浸透圧造影剤によって誘発される副作用の頻度と決定要因、放射線学。 1989, 170, 727-32.