Advion Interchim Scientific を使用したオリゴヌクレオチドの定性分析® HPLC-UV/MSシステム

計装
質量分析:ex expression CMS® コンパクト質量分析計(CMS)
HPLC: アバント®

はじめに

オリゴヌクレオチドは、その利点によりバイオ医薬品開発において大きな注目を集めています。
遺伝子またはタンパク質の発現を調節する能力。 彼らの臨床的成功は、いくつかのオリゴヌクレオチドベースの医薬品の承認または臨床試験への進出によって明らかです。【1] これらの薬剤には、アンチセンス オリゴヌクレオチド、低分子干渉 RNA (siRNA) 治療薬、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) ワクチンの開発成功に代表される mRNA ベースのワクチンなどが含まれます。 このような成果により、オリゴヌクレオチドの研究開発へのさらなる関心と投資が促進されました。

固相合成は、オリゴヌクレオチド配列を生成するために一般的に使用される方法です。 原料は通常、所望の純度レベルに応じて、脱塩、限外濾過、固相抽出 (SPE)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、分取液体クロマトグラフィー (prepLC) などのさまざまな技術を通じて精製されます。 イオンペアリング HPLC または分取 LC メソッドは、他の技術と比較して純度が高いため、多くの場合好まれます。

このアプリケーション ノートは、複数のオリゴ サンプルの HPLC/UV 分析を実証し、HPLC/CMS 分析を利用してそれらの分子量を決定することを目的としています。

方法

HPLC-UV/CMSシステム
クォータナリポンプとカラム選択バルブを使用すると、さまざまな分析で異なるバッファーとカラムを切り替えるプロセスが非常に簡単になり、手動での操作が不要になります。
カラムを取り外して溶媒を交換します。 この自動化により、分析プロセスの効率と利便性が大幅に向上します。

表 1: 項目楽器リスト


オリゴ(dT) 12-18 プライマー
Oligo(dT) 12-18 プライマー (Thermos Fisher Scientific、MA) を使用して、オリゴヌクレオチド分析の HPLC 法をチェックしました。

これらのオリゴ(dT) 12-18 プライマーの分離は、Interchim Uptisphere Strategy 5 μm C18HQ カラム 250 x 4.6 mm を使用したイオンペア逆相 HPLC 法を使用して実行されました。 すべての分析で 10 μL アリコートを注入し、カラム温度を 30℃ に維持しました。 移動相 A の組成は 100 mM TEAA 水溶液で、移動相 B はアセトニトリルです。 流量は1ml/minです。

HPLC 分析は次のように進められました。サンプルの注入後、移動相 B を 10 分間 1% に設定しました。 その後、15 分間にわたって 24% まで直線的に増加しました。 25.1 分で、95% に増加し、このレベルを 2.4 分間維持してカラムを洗浄しました。 その後、27.6 分で 10% に低下し、カラム平衡化のために 2.4 分間維持しました。

図 1 は、HPLC メソッドが 12 つの Oligo(dT) 18 ~ XNUMX プライマーを効果的に分離することを示しています。

図 1: Oligo(dT)12-18 の HPLC/UV 分析


4 つのコンポーネントを含む RNA スタンダード
RNAオリゴヌクレオチド混合物(Aglient Technologies、CA)を、HPLC分析の前にDI水で10倍に希釈することによって調製した。 10 つの RNA 標準の配列は次のとおりです: 14 mer (CACUGAAUACCAAU)、17 mer (UCACACUGAAUACCAAU)、20 mer (UCAUCACACUGAAUACCAAU)、および 21 mer (GUCUCAUCACACUGAAUACCAAU)。

これらの RNA サンプルの分離は、オリゴ (dT)12-18 プライマーの場合と同様の HPLC 方法をわずかに変更して使用して実行されました。

HPLC 分析は次のように進められました。サンプルの注入後、移動相 B を 9 分間 1% に設定しました。 その後、10 分間にわたって 24% まで直線的に増加しました。 25.1 分で、95% に増加し、このレベルを 2.4 分間維持してカラムを洗浄しました。 その後、27.6 分で 9% に低下し、カラム平衡化のために 2.4 分間維持しました。

図 2 は、1 mer RNA サンプルと 20 mer RNA サンプルの間に 21 mer の違いがある場合でも、HPLC メソッドが 20 つの RNA サンプルを効果的に分離することを示しています。 合成中のほとんどの不純物は通常 N=21 mer または N+1 mer であるため、1 mer と XNUMX mer のこのベースライン分離は合成オリゴヌクレオチドの分析にとって重要です。【2]


ssDNA サンプル
17 mer (GTCAGCAAGGACATCGT)、18 mer(CATTTGAGTAGCCAACGC)、および 19 mer (GGACACTTTCATGCGAGTT) の XNUMX つの一本鎖 DNA サンプル (ssDNA) も、RNA サンプルに使用したものを修正した HPLC 方法を使用してテストされました。

各 ssDNA の濃度は 30 μM で、10 μL のアリコートを分析のためにカラムにロードしました。 HPLC 分析は以下の勾配を使用して実行されました。サンプル注入後、移動相 B (MPB) を 9 分間 1% に設定し、その後 15 分間かけて 24% まで直線的に増加しました。 25.1 分で、95% に増加し、このレベルを 2.4 分間維持してカラムを洗浄しました。 27.6 分で MPB は 9% に減少し、カラム平衡化のためにこのレベルを 2.4 分間維持しました。 分析の流量は 1.5 ml/min に設定されました。 RNA サンプルと比較して溶媒 B の 3 分あたりの変化が大きいにもかかわらず、図 XNUMX は、このメソッドが良好なベースライン分解能で XNUMX つの ssDNA サンプルを効果的に分離していることを示しています。

図 3: 1 つの ssDNA サンプル 3 ~ 1、ssDNA-17 を含む 2 つの一本鎖 DNA サンプルの HPLC/UV 分析: 18 mer (GTC AGC AAG GAC ATC GT)。 ssDNA-3: 19 mer (CAT TTG AGT AGC CAA CGC) および ssDNA-XNUMX: XNUMX mer (GGA CAC TTT CAT GCG AGT T)。


ssDNA サンプルの純度分析
図 3 に示す ssDNA サンプルに使用したのと同じ方法で、ssDNA サンプルの純度分析にも使用しました: 19 mer (5'-TGGCGGGCGTACCTGGACT-3')。

図 4 は、Advion Data Express ソフトウェアを使用して測定した 19 mer ssDNA 4 の 74.3 nm での UV 純度が 260% であることを示しています。


F.5 純度分析に使用される ssDNA サンプルの MS 分析
オリゴヌクレオチドの HPLC/MS 分析は、Advion AVANT を使用して実行されました。® Advion Ex と組み合わせた HPLC システム expression CMS® CMS-L。 MS 分析には、寸法 2.6 x 18 mm の Interchim Uptisphere Strategy 50 μm C2.1-HQ カラムを流速 0.2 ml/分で使用しました。 カラム温度は55℃に設定した。

オリゴヌクレオチドの質量分析に TEAA を使用する場合と比較して、TEA と HFIP を組み合わせたイオンペア試薬は性能が大幅に向上します。 したがって、このアプリケーション ノートでは、オリゴヌクレオチドの HPLC/MS 分析に TEA および HFIP イオンペア試薬を使用することに焦点を当てます。

移動相は、移動相 A として 15 mM TEA および 10 mM HFIP 水溶液、および移動相 B としてメタノールから構成されました。合計 HPLC 実行時間は 25 分で、5% の溶媒 B で 1 分間開始しました。
次に、B のパーセンテージは 6 分間で 14% まで増加し、続いて 95 分で 15.1% まで増加し、目的の化合物を溶出するために 2.9 分間維持されました。 続いて、%B を 5% に減らし、次の分析の前にカラムを平衡化するために 6.9 分間このレベルに維持しました。

MS 分析は、MS スキャン範囲を 500 ~ 2000 Da に設定してネガティブ ESI モードで実施しました。 図 5b は ssDNA-4 の MS スペクトルを示しており、m/z 1463.9 (4-)、1170.8 (5-)、(975.8 (6-)、936.0 (7-)、731.8 (8-) にピークを持つ荷電エンベロープを示しています) Data Express での電荷デコンボリューションにより、ssDNA サンプルの非電荷質量は 650.2 Da と決定され、これは理論値 9 Da とほぼ一致します。

図 5: ssDNA-4 (5-TGG CGG GCG TAC CTG GAC T-3)、MW 5860.8 Da の HPLC/MS 分析


図 6: ssDNA-5 (5-GGGTGG-CAT-TAT-GCT-GAG-T-3)、分子量 5914.9 の HPLC/MS 分析


さらなるサンプル例の MS 分析
ssDNA-5 (5'-GGG-TGG-CAT-TATGCT-GAG-T-3') の MS スペクトルを図 6 に示します。これは、m/z 1477.8(4-)、1182.1() にピークを持つ荷電エンベロープを示しています。 5-)、984.7(6-)、843.8(7-)、738.2(8-)。 電荷デコンボリューションにより、ssDNA-5 の非電荷質量は 5913.9 であると決定されました。これは、理論値 5914.9 とほぼ一致しています。

要約

TEAA (酢酸トリエチルアンモニウム) イオン対試薬と組み合わせた粒子サイズ 5 μm の C18HQ カラムの使用は、オリゴヌクレオチド HPLC 分析に適したソリューションであることが実証されています。

オリゴヌクレオチドの MS 分析では、AVANT と組み合わせて、イオンペアリング試薬として HFIP (ヘキサフルオロイソプロパノール) および TEA (トリエチルアミン) を使用した同じ C18HQ カラムを使用できます。® HPLC-UV/CMSシステム。 この方法は、オリゴヌクレオチドの追加の正確な質量測定をもたらすことが証明されています。

全体的には、Interchim C18HQ カラムと適切なイオンペア試薬を AVANT と組み合わせて利用します。® HPLC-UV および HPLC-CMS システムは、オリゴヌクレオチドの純度分析および特性評価のための信頼できるソリューションを提供します。

リファレンス
【1]Roberts, TC、Langer, R. & Wood, MJA オリゴヌクレオチドドラッグデリバリーの進歩。 Nat Rev Drug Discov 2020、19、673–694
【2]マルチナ C. 他オリゴヌクレオチド: 合成、特性評価、および精製における最新の傾向と革新的なアプリケーション、バイオテクノロジー J. 2020、1900226

黒米中のシアニジン-3-グルコシドの抽出、同定、精製および定量

計装
フラッシュ: puriFlash® 5.250、XS-Vap®
マススペック: ex expression CMS® コンパクト質量分析計(CMS)
HPLC: アバント™

はじめに
米は世界、特にアジア諸国において最も重要な食品の一つです。 色素のある米の品種の中でも、黒米はその高い栄養価と有益な健康特性によりますます注目を集めています。 黒米は、シアニジン-3-グルコシド(Cyn-3-Glu)、シアニジン-3-ルチノシド(Cyn-3-Rut)、ペオニジン-3-グルコシド(Pn-3-Glu)などを含むアントシアニンが豊富な色素米です。アントシアニン。 シアニジン-3-グルコシドは、黒米に含まれる主なアントシアニンです。

このアプリケーション ノートでは、シアニジン-3-グルコシドがどのように黒米から抽出され、prepLC/Flash システムで精製されるかを示します。 Cyn-3-Glu の量と純度は、認定された参照標準を利用して測定されます。

方法
シアニジン-3-グルコシド抽出
黒米は地元の食料品店から購入し、スパイスグラインダーで細かい粉末に粉砕し、次の方法で抽出しました。
1. 30 グラムの粉砕黒米を、200 N HCl (1.0:85、v/v) で酸性化したメタノール 15 mL と混合し、15 分間超音波処理しました。
2. 混合物を 7500 rpm、4℃で 5 分間遠心分離しました。 上清をきれいなフラスコにデカントした。 ペレットを、1.0N HCl(85:15、v/v)で酸性化したメタノール200mlで再度抽出し、15分間超音波処理した。
3. 25 つの抽出からの上清を合わせ、ロータリーエバポレーターを使用して XNUMX ml に減らしました。
4. 濃縮抽出物の少量を HPLC/UV/MS 分析用に水で 10 倍に希釈し、残りを直接 PrepLC/Flash システムにロードして精製しました。

分析用 HPLC/UV/MS セットアップ
表1: 黒米抽出物の分析 HPLC/UV/MS メソッド。

黒米抽出物の分析 HPLC/MS 分析
黒米の濃縮抽出物を、HPLC/CMS 分析のために蒸留水で 10 倍に希釈しました。

質量範囲が 200 ~ 800 Da の HPLC/MS クロマトグラムを図 1a に示します。 12.10 分のピークからの平均 MS スペクトルを図 1b に示します。 m / z 449.2 はポジティブ ESI モードで検出されました。 ソース内 CID を使用した MS スペクトルを図 1c に示します。 m / z 287.0

図1:ライブテーリング A)。 黒米抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、B)。 12.10 分のピークの平均質量スペクトル、C)。 12.10V でのソース内 CID での 30 分のピークの平均質量スペクトル。

MSスペクトルデータベース検索
Advion Data Express の MS スペクトル データベース検索により、12.1 分で溶出された化合物はシアニジン-3-グルコシド (Cyn-3-Glu) であることが確認されます。

図2:ライブテーリング 図 1c の平均 MS スペクトルのライブラリ検索結果の抜粋。

Peak Express ソフトウェアは他のアントシアニンの検出に役立ちます
Data Express に実装された Peak Express™ ソフトウェアは、検出されるすべてのイオンの強度の変化率と標準偏差を動的に決定し、事前に設定されたしきい値設定を超えるイオンのみを表示できます。

Peak Express™ は、TIC クロマトグラム (図 14.41a) ではほとんど示されていない、ΔIC クロマトグラム (図 3b) の 3 分の別のピークの検出に役立ちます。 ソース内 CID を使用した ΔS デルタ スペクトルは、m/z 463.3 および 301.1 で検出された XNUMX つのイオンを示しています。

MSスペクトルデータベース検索により、ペオニジン-3-O-グルコシドであることが判明しました(検索結果を図4に示します)。

図3:ライブテーリング A)。 黒米抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、B)。 黒米抽出物のΔIC クロマトグラム C)。 14.41V でのソース内 CID での 30 分のピークの ΔS デルタ スペクトル

図4:ライブテーリング 図 3c の ΔS デルタスペクトルのライブラリ検索結果

黒米抽出物の HPLC/UV 分析
黒米抽出物も HPLC/UV で分析しました。 3 分の Cyn-12.01-Glu の 278 つの特徴的な UV 吸収ピークが 518 nm と 5 nm に見られます (図 XNUMXb)。

PrepLC/Flash システムによる精製では、520 nm を使用してフラクション収集が開始されます。

図5:ライブテーリング A)。 黒米抽出物の HPLC/UV クロマトグラム、B)。 12.07 分のピークからの UV 吸光度プロファイル

cyn-3-glu 精製のための PrepLC メソッド
表2: Cyn-3-Glu 精製のための PrepLC メソッド

精製
黒米抽出物の精製は Advion Interchim Scientific puriFlash で実行されます® 5.250 PrepLC/フラッシュ システム。

溶媒と分離方法の詳細情報は方法表に記載されています。 黒米抽出物 (3 ml サンプル) の典型的な PrepLC/UV クロマトグラムを図 6 に示します。

収集された各画分はさらに HPLC-UV/MS で分析され、同定が確認され、追加の純度分析が行われます。

図6:ライブテーリング puriFlash 上の黒米抽出物の prepLC クロマトグラム (520 nm)® 5.250 PrepLC/フラッシュシステム

フラクション 2、5、および 8 の HPLC/UV 分析
すべての画分を HPLC/UV/MS で分析します。 画分 1 の HPLC/MS 分析では、m/z 611 の不純物と、Cyn-3-Glu の低い UV 応答が示されました。 フラクション 2 ~ 8 の純度は 97.6 % 以上です。 フラクション 2、5、および 8 の HPLC/UV クロマトグラムは、図 7 に示す例として使用されており、純度 97.6 は 2%、フラクション 100 および 5 は 8% です。

最初の画分を除いて、すべての画分を乾燥のために合わせた。 画分の乾燥は Advion Interchim Scientific puriFlash で実行されました。® 室温での XS-Vap システム。 3 g の黒米から精製された Cyn-30-Glu の重量は 25.8 mg です。

図7:ライブテーリング 画分 a) 画分 2、b) 画分 5、c) 画分 8 の HPLC/UV クロマトグラム。

HPLC/UV による C3G の定量
乾燥サンプルの最終純度を確認するために、Cyn-3-Glu の認定参照標準を使用して乾燥 Cyn-3-Glu の定量分析を行い、その純度を確認しました。 Cyn-3-Glu リファレンスの HPLC 検量線を図 8 に示します。

Cyn-3-Glu の測定量は 25.5 mg、純度は 99.0% です。

図8:ライブテーリング Cyn-3-Glu 参照標準の HPLC/UV 検量線

要約
開発された HPLC/UV/MS および PrepLC メソッドを使用すると、黒米抽出物中の Cyn-3-Glu を分離、精製、定量することができます。

25.5 mg の Cyn-3-Glu が 30 g の黒米から純度 99.0% で精製されました。
Interchim PrepLC/Flash と Advion HPLC-UV/CMS の組み合わせは、米サンプルまたは Cyn-3-Glu を含むサンプルから Cyn-3-Glu を抽出および精製するためのシンプルでコスト効率の高いソリューションです。

この一般的なワークフローに従います。

HPLC/CMS は、天然物精製における標的化合物の同定と純度分析のための簡単な方法を提供します。

puriFlash® 5.250 PrepLC および ex を使用した複雑な混合物からの生理活性ペプチドの精製 expression CMS® CMS検出器

計装
マススペック: ex expression CMS® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム
フラッシュ: puriFlash® 5.250 分取LC
HPLC: AVANT®

著者
チャントン・ハオ
Advion Interchim Scientific

はじめに
近年、バイオ医薬品企業は、従来の小分子薬と比較して特異性と選択性が強化されたペプチド/タンパク質ベースの薬剤を採用することが増えています。 ただし、創薬プロセスにおけるペプチド/タンパク質の精製は、最終製品の安全性と有効性を確保するために非常に重要です。 生物活性のある標的化合物の可能な限り最高の純度レベルを達成することは、毒性のリスクを最小限に抑え、規制基準に準拠するために不可欠です。【1,2]

チーズ製造の副産物であるホエイタンパク質単離物には、さまざまなグリコマクロペプチドと 6757 つの重要な生理活性ペプチド、分子量 (MW) 6787 Da のカゼイン マクロペプチド A (CMP) と MW XNUMX Da のカゼイン マクロペプチド B (CMPb) が含まれています。 。 カゼインなどの個別成分の抽出・精製
マクロペプチドは、その生物活性を調べるために不可欠です。【3]

このアプリケーション ノートでは、例としてホエータンパク質単離物と XNUMX つのカゼイン マクロペプチドを使用して、puriFlash で構成されるシステムを使用した生物活性成分の単離と精製を実証します。® 5.250 prepLC がオンラインで元に接続 expression CMS® CMS検出器。 この組み合わせにより、生物活性のある標的ペプチドやタンパク質に効果的に反応しない可能性がある UV や ELSD などの従来の検出器と比較して、より高い選択性と感度が得られます。


Advion Interchim Scientific
puriFlash® 5.250


Advion Interchim Scientific
ex expression CMS® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム

方法
ホエイプロテインアイソレートの調製
• このアプリケーションで使用されるカゼイン マクロペプチドの単離手順は、斉藤忠夫の研究に基づいています。【4] いくつかの変更を加えて。
• 地元の食料品店から購入したホエータンパク質単離物のサンプル 50 g を、500% 水と 70% メタノール (v/v) の溶媒混合物 30 mL と混ぜ合わせました。 混合物を70℃で90分間超音波処理し、次いで減圧濾過した。
・ロータリーエバポレーターを使用して減圧下、40℃でメタノールを除去することにより、得られた濾液を300mLの体積まで濃縮した。 次いで、それを4℃で1時間保管した。 続いて、等量の冷エタノールを溶液に添加し、混合物を5分間ボルテックスしてから、4℃でさらに4時間保存した。
・混合物を0.5μmフィルターを使用して減圧濾過した。 次いで、減圧下でロータリーエバポレーターを使用して、最終濾液を50mLの体積まで濃縮した。
• 濃縮抽出物の 100 μL アリコートを 900 μL の脱イオン (DI) と混合しました。
分析用 HPLC/MS 分析用の水。
• 残りの濾液は、puriFlash を使用したペプチド精製に使用されました。® 5.250 PrepLC システムと ex を組み合わせたシステム expression CMS® CMS検出器。

表1: 分析 HPLC/MS メソッドのセットアップ

分析 HPLC/MS メソッドのセットアップ
ホエイプロテイン単離物からの液体抽出物は、AVANT を使用して最初に分析されました。® HPLC/CMS システムおよび使用した 4.6 mm カラム用に開発されたクロマトグラフィー分離メソッド (表 1)。

図 1a は、液体抽出物の HPLC/MS クロマトグラムを示しています。 6.44 分のピークからの平均 MS スペクトルは、化合物が少なくとも XNUMX つの質量を持つ多重荷電ペプチドであることを示しています。 m / z 755.2、849.4、970.6、1132.1、および 1358.6 (図 1b) が充電プロファイルを形成します。

ソフトウェア電荷デコンボリューションにより、ペプチドの非電荷質量は 6787.4 Da であると決定され、これはカゼイン マクロペプチド B (CMPb、理論質量 6787 Da) であることを示しています (図 1c)。


Advion Interchim Scientific
AVANT® (U)HPLC


図1:ライブテーリング (a) ホエータンパク質単離物からの液体抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、(b) RT 6.44 分のピークからの平均 MS スペクトル、(c) RT 6.44 分のペプチド溶出ピークのデコンボリューションされた非荷電質量。


図2:ライブテーリング (a) ホエータンパク質単離物からの液体抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、(b) RT 11.02 分のピークからの平均 MS スペクトル、(c) RT 11.02 分で溶出するペプチドのデコンボリューションされた非荷電質量。

11.02 分で溶出するピークから得られた平均 MS スペクトルは、この化合物が、その電荷プロファイルを形成する m/z 751.5、845.4、966.1、1126.8、および 1352.1 の質量を持つ多重荷電ペプチドでもあることを示唆しています (図 2b)。

同様に、電荷デコンボリューションにより、このペプチドの非荷電質量は 6755.3 Da であると決定され、理論的質量が 6755 Da であるカゼイン マクロペプチドの A 変異体、CMP を示します (図 2c)。


Advion Interchim Scientific
puriFlash® 5.250、MS スプリッターおよび元 expression CMS® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム

PrepLC/MS クロマトグラフィー
次のステップでは、分析分離メソッドをカラム ID 4.6 mm からカラム ID 30 mm までのより大きな分取スケールに置き換え、puriFlash での XNUMX つの CMP (カゼイングリコマクロペプチド) の精製用にさらに最適化しました。® 5.250 PrepLC/Flash システムをオンラインで元に接続 expression CMS® CMS検出器。

ホエータンパク質分離物の PrepLC-UV/MS クロマトグラムを図 3 に示し、パラメーターを表 2 に示します。

分画収集は、より高い選択性と感度のために選ばれた MS シグナルに基づいて開始されました。 970〜971 DaのXICをCMPbの検出に使用し、965〜966 DaのXICをCMPの検出に使用しました。

画分11〜17と画分18〜22の組み合わせ中の有機溶媒を、負圧下でロータリーエバポレーターを使用して除去し、残った水性溶媒を除去した。
LABCONCO Freezone 2.5L(−50℃)凍結乾燥機を使用して溶液を乾燥させ、それぞれ10mgの乾燥収集物を得た。その後、これをその後のHPLC/UV/MS分析のために10mlの脱イオン水に溶解した。 純度分析の結果を図 2.5 および 50 に示します。

表2: PrepLC/MS メソッドのセットアップ


図3:ライブテーリング XNUMX 種類のホエータンパク質単離物の PrepLC-UV/MS クロマトグラム

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CMPbの純度分析
プールした画分 11 ~ 17 の CMPb の純度分析を図 4 に示します。MS 分析では、970.8、1132.3、1358.6、1968.2 の m/z で 4 つの主要なイオンが検出されたことが示されています (図 XNUMXb)。

図 4b の平均質量スペクトルにより、5.94 分のピークの非荷電質量は 6788.4 と決定されました (CMPb、図 4c)。 ただし、MS 分析では、6758.3、6773.5、6804.8、および 6868.4 Da の XNUMX つの微量成分も検出できます。

得られた CMPb の UV 純度は 86.7% (図 4d) ですが、追加の MS データに基づくと、化合物の純度は実際にはそれよりも低くなります (推定 80%)。

分析実行の UV 分析に基づいて、プールされた画分 18 ~ 22 の CMPa は 94.7% と測定されました (図 5a)。

デコンボリューションされた非荷電質量分析では、CMP の予想主要質量 6756.2 (図 5b) と、CMP の酸化型である 6774.6 の XNUMX つの微量成分が示されています。

繰り返しますが、この例は、ペプチドやタンパク質などの生理活性化合物の MS 検出の価値と、UV と比較して MS 検出の優れた特異性を示しています。


図4:ライブテーリング (a) 11 ~ 17 のプールされた画分の HPLC-MS クロマトグラム、(b) RT 5.94 分で溶出するピークの平均 MS スペクトル、(c) (b) からの非荷電質量、(d) プールされた画分の HPLCUV クロマトグラム11-17の。


図5:ライブテーリング (a) 18~22 のプールされた画分の HPLC-UV クロマトグラム。 (b) CMPa のデコンボリューションされた非荷電質量。

最終的な全体的な純度は約 90 % と推定されます。 XNUMX% は、創薬における生物活性分子としては優れた値です。

収率は犠牲になりますが、選択的分画を使用すると純度をさらに向上させることができます。 たとえば、CMP のフラクション 20 の HPLC-UV/MS 分析 (図 6a) では、UV 純度が 99.0% (図 6d) であり、MS 分析では酸化副生成物が存在しないことが示されています。


図6:ライブテーリング (a) フラクション 20 の HPLC-MS クロマトグラム、(b) RT 5.71 分のピークの平均 MS スペクトル、(c) デコンボリューションした CMPa の非荷電質量、(d) フラクション 20 の HPLCUV クロマトグラム。

要約
puriFlash® 5.250 PrepLC/Flash システム、オンラインで ex と結合 expression CMS® CMS 検出器は優れた性能を実現し、複雑なマトリックスからの生理活性マクロペプチドの選択的精製を高い信頼性で容易にします。 UV または ELSD 検出器と比較して、質量分析計は優れた選択性と感度を実現します。

このアプローチの応用例では、カゼイン グリコール マクロ ペプチドを単離し、合わせた分画を通じて 80% (CMPb) ~ 90% (CMPa) の範囲の純度を高収率で得ることができます。 選択的画分を使用すると、最大 99.0% までのさらに高い純度を達成できます。

 

参考文献

【1]グラスランド、S.、他。 (2008年)。 タンパク質の生産と精製。 Nature Methods、5(2)、135-146。
【2]バイオ医薬品の加工: 製造プロセスの開発、設計、実装。
【3]リン・T.ら(2021) 牛乳中の生物活性物質: 化学、技術、および応用 栄養レビュー v79(S2):48–69
【4]斉藤 哲也(1991) スイートチーズホエーからのカゼイノグリコペプチドの新しい単離方法。 J. デイリー サイエンス74、2831-2837

Advion Interchim Scientific SOLATIONを使用した血液分析® 元素分析用ICP-MS

はじめに

微量元素は人間の適切な生物学的機能に不可欠であり、微量元素のレベルの違いは多くの病気や状態を示しています。 非必須微量元素は、人間または産業活動によって生成され、土壌、空気、水、食品に堆積した環境汚染物質の結果として人体にも存在します。 ICP-MS を使用すると、血液、血清、尿中のこれらの必須および非必須微量元素を簡単に測定および監視できます。

このアプリケーション ノートでは、SOLATION を使用して、主要な有毒元素と必須元素について少量の血液サンプルを日常的に分析するための迅速な方法を紹介します。® シンプルな「希釈してシュート」サンプル前処理を使用する誘導結合プラズマ質量分析計 (ICP-MS)。 ICP-MS の高感度と広いダイナミック レンジは、栄養学的に関連する元素を高レベルで同時に測定しながら、微量レベルの重金属を測定するのに特に重要です。 血液は、多くの分析対象物に影響を与える炭素および塩素ベースの干渉の形成を促進するタンパク質と塩が豊富な複雑なマトリックスです。 Advion Interchim Scientific の SOLATION の衝突セル® ICP-MS はこれらの干渉を克服するために必要です。

SOLATION® ICP-MS には、多原子イオン、特に遷移金属元素からの干渉に対処するために使用される八重極衝突セルがあります。 堅牢な日常的な微量元素分析では、ドリフトや不必要なダウンタイムを引き起こす可能性のある八極セルが汚染されないことが重要です。 界面を通過するイオンは 90 度回転し、四重極偏向器 (QD) を使用して八重極の入口に集束されます。 軽い粒子と中性粒子は QD を通ってセルから離れていきます。

SOLATIONのコリジョンセル® ICP-MS は、衝突ガスとして機能する He をセルに充填する「He ガス」モード、またはセルを空にする「ノー ガス」モードで操作できます。 「He Gas」モードは多原子干渉を受ける同位体に使用され、「No Gas」モードは残りの同位体に使用されます。 SOLATION の「He Gas」モードと「No Gas」モードの迅速な切り替え® (< 5 秒) により、分析実行を短く保つことができるため、生産性が向上します。

実験と結果

試薬と材料

硝酸 (Aristar Plus、微量金属グレード)
Triton X-100 (特に精製された、Roche 化学製品)
水、タイプ 1 (18.2 MΩ、Elga 使用時点システム)
メタノール (LC-MS 用ハイパーグレード、Supelco)
Mg、Ca、Mn、Cu、As、Se、Cd、Pb、Ge、Rh、Au、および Ir 標準溶液 (1000 μg/ml、クラリタス ppt グレード) 
微量元素全血 L-1 (SRM1) (血清ノーム)
微量元素全血 L-2 (SRM2) (血清ノーム)
微量元素全血 L-3 (SRM3) (血清ノーム)
ブランク全血 (WB(F)) (UTAK)
酸希釈剤: (0.5% 硝酸、0.05% Triton X-100、2% メタノール、0.25 μg/mL (ppm) Au、および内部標準: 10 μg/L (ppb) Ge、Rh、および Ir)

テーブル1: 校正濃度と標準濃度

規格

このメソッドは、全血サンプル中の Mg、Ca、Mn、Cu、As、Se、Cd、および Pb を測定するために開発されました。 これらの元素は、血液中の一般的に測定される金属の一部を表すように選択されており、必須元素と有毒元素の両方をカバーしています。 標準は、血液中に通常見られる範囲をカバーするために、1 つの濃度レベルの元素を含む酸希釈剤を使用して調製されました。 表 2 は、各レベルの標準濃度とそのレベルに含まれる元素の概要を示しています。 各分析物に使用される分析モードと内部標準を表 XNUMX に示します。ICH ガイドラインでは、直線性を確立するには最低 XNUMX つの濃度が必要です。 キャリブレーションブランクでは XNUMX つを使用し、この要件を満たします。

テーブル2: 分析モードと内部標準

サンプルと準備

サンプルは 15 mL の金属を含まない遠心分離管で調製されました。 酸希釈剤 (14.7mL) を各チューブに加え、続いて 0.3mL の血液サンプルを加えて 1:50 希釈しました。 チューブに蓋をし、3~5回反転させて完全に混合した。

サンプルはSOLATIONを使用して分析されました® ICP-MS。 ザ・ソレーション® この分析の機器構成は、Micromist 同心ネブライザーと一体型トーチを備えたサイクロン スプレー チャンバーでした。 研究全体を通じて、Ni サンプラーとスキマー コーンが使用されました。 機器の動作条件を表 3 にまとめます。

テーブル3: ICP-MS 動作パラメータ

結果と考察

我々は、精度、精度 (再現性)、検出限界およびメソッド検出限界 (DL および MDL)、および定量限界 (LOQ) に関する特定の要件を定義するメソッド検証に関する ICH の「分析手順の検証」ガイドラインに従いました。 

このメソッドの精度は、メソッド内のすべての要素の濃度値が認証されている Seronorm 参照物質を使用して確立されました。 これらの材料は 95 回測定され、分析結果が Seronorm によって提供される認定値および XNUMX% 信頼限界と比較されました。 

これらの値は図 1 にプロットされており、認定された最小値と最大値がボックスとして表されています。 私たちの分析値は図 1 にプロットされており、どの場合でも、私たちの値は限界内にあり、ICH 仕様を容易に満たす高度な精度を示しています。

精度の 150 番目の尺度はスパイクの回復です。 UTAK の「ブランク血液」(WB(F)) サンプルに、15 mL チューブ内の Ca と Mg を除くすべての元素の標準ストック溶液 XNUMX μL をスパイクしました。 回収率は次のように計算されます。 

スパイク回収率を表 4 に示します。すべての回収率は 90 ~ 110% 以内であり、スパイクされた分析物の優れた回収率を示しています。

テーブル4: スパイクの回復

メソッドの精度は、2 つの Seronorm レベル 2 (SRM2) サンプルの再現性として測定されます。 Seronorm level 2 (SRM3) の 2 つのサンプルを調製、希釈し、個別に分析しました。 結果は、反復間の RSD が XNUMX% 未満であることを示しています。 XNUMX つの反復実験の %RSD を図 XNUMX に示します。


図1: 認定血清ノーム物質分析の精度


図2: セロノーム材料分析の精度

メソッドの検出限界 (MDL) および定量限界 (LOQ) は、XNUMX つの酸希釈剤ブランクからのシグナルの標準偏差 (σ) を使用して決定されました。 酸希釈剤ブランクは、サンプルと同じ技術および装置を使用して調製され、各分析の最後に含まれ、その後に校正標準が続きました。 MDL と LOQ は次のように計算されます。 

ここで、S は校正スロップであり、次のようになります。

校正勾配は内部標準に対する分析対象物であるため、校正標準を使用してカウント/秒/ppb を決定しました。 これらの値は計算され、希釈係数を考慮して 50 を掛けられ、μg/L (ppb) で表されます。 表では、MDL と LOQ が、セロノーム 2 (SRM2) で表される生理学的正常値と比較してプロットされています。 ほとんどの分析対象物、特に主要元素のカルシウムとマグネシウムでは、MDL と LOQ は比較すると非常に小さいです。 ただし、セレンなどのより困難な分析物の場合でも、MDL は、レベル 2 (SRM2) であるにもかかわらず、これら 2 つの SRM の中でセレン含有量が最も低いセロノーム 2 (SRMXNUMX) よりも XNUMX 桁低くなります。 


図3: 生理学的正常値と比較した LOQ および MDL
*Seronorm L2 で表され、典型的な、または平均的な人間の値を表すように定式化されています。

要約

このアプリケーション ノートでは、Advion Interchim Scientific SOLATION を使用した血液中の微量元素の分析について報告します。® ICP-MS。 血液は複雑で困難なマトリックスです。 しかし、これらのデータは、血液中の高レベルおよび微量元素の正確かつ正確な濃度を与える、簡単な「希釈してシュート」サンプル前処理法の使用を裏付けています。 スパイクされたサンプルと CRM の両方で優れた回収率が観察されました。 四重極ディフレクターと衝突セルの組み合わせにより、ドリフトが最小限に抑えられ、長期間にわたって精度と精度が保証されます。 報告された方法は、SOLATION の高速衝突セルのガス切り替え機能の恩恵を受けています。® 血液中の広範囲の元素を分析し、迅速かつ正確かつ再現性のある結果を得ることができます。

Advion Interchim Scientific AVANT™ HPLC および ex を使用したイオヘキソールの分析 expression CMS® CMSシステム

はじめに

イオヘキソールは、X 線分析のコントラストを向上させる、広く使用されている非イオン性造影剤です。 その低い浸透圧は、腎臓を介した迅速なクリアランスを可能にし、再吸収とさらなる代謝を防ぎます【1]. これにより、イオヘキソールは他の造影剤と比較して安全性プロファイルが優れた化合物になります【2]. 

多くの臨床イメージング アプリケーションでは、造影剤/造影剤が患者に投与され、スキャンのコントラストと空間分解能が向上します。 造影剤の毒性と副作用のため、安全な使用と正確な診断のために、既知の濃度で調製し、純度を分析することが非常に重要です。 

このアプリケーション ノートでは、イオヘキソール分析のためのシンプルで正確な HPLC-CMS メソッドを紹介します。

方法

メソッドのセットアップ

アプリケーションで使用したすべての溶媒は HPLC グレードでした。

Sigma Aldrich から XNUMX つのイオヘキソール標準を入手しました。

99.99 つは純度 95% の認定標準物質で、もう XNUMX つは純度が XNUMX% 以上でした。

すべての実験は、Advion Interchim Scientific exで実行されました expression CMS® 表 1 に示すパラメータを持つ AVANT™ UHPLC システムと組み合わせたコンパクト質量分析計。

テーブル1: HPLC/MS法

イオヘキソールのHPLC/UV/MS分析

室温では、イオヘキソールは HPLC/UV/MS 分析で検出された XNUMX つのピークで異性化します。 

これらの 1 つのピーク (図 XNUMXA) は、イオヘキソールの中央のベンゼン環に結合したかさばるヨウ素原子によるアニリド N-アセチル基の妨害された回転に由来します。 これらの XNUMX つの化合物は本質的に「回転異性体」であり、水溶液中で室温でゆっくりと入れ替わります。

両方のピークは、821.9 で同じ m/z を示す MS 分析で確認され (図 1B および 1C)、インソース CID 質量スペクトルに違いは見られませんでした (図 2A および 2B)。 

両方の回転異性体は、X 線分析における化合物の毒性とイメージング能力の向上に寄与するため、このアプリケーション ノートでは、両方のピークの合計を以降のイオヘキソール分析に使用します。 


図1: (A) イオヘキソールの HPLC クロマトグラム (254 nm)、(B) m/z 821.8 でのプロトン化イオヘキソールの抽出イオン クロマトグラム、(C) RT 4.06 分でのピークからの平均 MS スペクトル。


図2: (A) RT 3.61 分でのピークからの平均インソース CID 質量スペクトル、(B) RT 4.06 分でのピークからの平均インソース CID 質量スペクトル。

HPLC/UV分析による純度測定

イオヘキソール サンプルの HPLC レスポンスを、同様の濃度のイオヘキソール認定標準のレスポンスと比較することにより、サンプルと認定標準のピーク面積比から、濃度と純度を迅速に分析できます。 

イオヘキソールの濃度比を計算する式を以下に示します。

イオヘキソール サンプルと認定参照の HPLC クロマトグラムを図 3A と 3B に示します。

合計された 714 つのピーク面積の平均値は、イオヘキソール サンプルでは 3 (図 740A)、イオヘキソール参照標準では 3 (図 0.0964B) です。 濃度比の計算では、サンプル中のイオヘキソールの計算濃度は 96.4 mg/ml であり、これは 95% の純度に相当します。


図3: (A) イオヘキソール サンプル (254 mg/ml) の HPLC クロマトグラム (0.1 nm) (B) イオヘキソール参照標準 (254 mg/ml) の HPLC クロマトグラム (0.1 nm)。

HPLC/UV分析による定量

イオヘキソールサンプルの純度をより正確に確認するために、25 ~ 500 μg/mL の 0.9999 つの異なる希釈レベルと各濃度で 4 回の注入を使用して、イオヘキソール認定標準物質の検量線を作成しました。 得られた線形キャリブレーション関数の R 二乗値は XNUMX (図 XNUMX) で、優れた直線性を示しています。 

イオヘキソール キャリブレーション カーブ アプローチにより、イオヘキソール サンプルの純度は 97.5% であると決定されました。 

この値は、サンプルの最低 95% の記載された純度のすぐ上でもあり、イオヘキソール サンプルとイオヘキソール参照標準の直接 UV 応答比分析による測定値とはわずか 1.1% しか異なりません。

認定された参照標準物質が利用できる場合、校正機能または直接 UV 応答比分析による純度決定の両方を、UV 吸光度のある有機化学物質に使用できます。

キャリブレーション関数法は、より正確な測定を提供します。


図4:HPLCクロマトグラム(254 nm)によるイオヘキソールの検量線

要約

Advion Interchim Scientific AVANT™ (U)HPLC システムは、イオヘキソールで示されているように、造影剤の純度分析のための正確なクロマトグラフィー法を提供できます。 UHPLC と Advion Interchim Scientific ex の結合 expression CMS® コンパクト質量分析計は、ターゲット化合物の質量と質量による確認を提供するだけでなく、 インソースのフラグメンテーションパターンだけでなく、不純物の迅速な測定も可能にします。 

参考文献
【1] T. Almen、非イオン性造影剤の開発、Invest. ラジオル。 (1985) 調査放射線学。 1985、20(1)、S2-S9。
【2] RD Moore、EP Steinberg、NR Powe、RI White、JA Brinker、EK Fishman、SJ Zinreich、CR Smith、高浸透圧造影剤によって誘発される副作用の頻度と決定要因、放射線学。 1989, 170, 727-32.

ウコン粉末からの 3 つのクルクミノイドの抽出と精製

計装:
フラッシュ: puriFlash® XS520
TLC: Plate Express TLCプレートリーダー
マススペック: ex expression CMS® コンパクト質量分析計
サンプリング: ASAP®® 直接分析プローブ

はじめに

クルクミノイドは、ウコンの根 (Curcuma longa) に由来する天然のポリフェノール化合物です。 抗酸化作用があると報告されています1. クルクミンはウコンに含まれる主要なクルクミノイドです。 栄養補助食品や化粧品の成分、料理の香料、黄橙色の食品着色料として一般的に使用されています。

このアプリケーション ノートでは、Advion Interchim Scientific puriFlash を使用したフラッシュ クロマトグラフィーを使用して、ウコン粉末から 3 つのクルクミノイドを分離および精製する方法について説明します。® XS520 Plus、Plate Express™ TLC プレートリーダーおよび ex を使用した質量分析を備えた TLC expression CMS® CMS が表示されます。 分数は、大気固体分析プローブ (ASAP) を使用して特定されました。®).

クルクミノイド抽出

ウコン粉末を秤量し(57.3g)、広口ガラス瓶に移した。 エタノール(250mL、200プルーフ)をボトルに加え、ホイルで覆いながら混合物を18時間撹拌した。 目的の化合物は光に敏感です。 次に、スラリーを濾過し、濾液を濃縮乾固して、琥珀色の油(6.4g)を形成した。

図1:ライブテーリング クルクミノイドの構造。

図2:ライブテーリング 市販のウコン粉末(左)と粗抽出油(右)。

TLC/MS分析

exとペアになったAdvion Interchim Scientific Plate Express™ expression CMS® CMS により、精製やサンプル調製を必要とせずに、TLC プレート上のスポットを簡単に識別することができます (図 3)。

最初の TLC 分析では、4 つのスポットが示されました (ジクロロメタン:メタノール、97:3)。 対象のクルクミノイドで予想されるように、下の 3 つのスポットは強い蛍光性を示しました。 TLC スポットは、負イオン モードで APCI イオン化によって分析されました。 下の XNUMX つのスポットは、質量分析によって特徴付けられました。

図3:ライブテーリング Advion Interchim Scientific ex expression CMS® CMS と Plate Express™ TLC プレート リーダー (左) と TLC プレート抽出ヘッドの拡大図 (右)。

図4:ライブテーリング 365 nm で視覚化された開発済み TLC プレート。 クルクミン (上)、デメトキシクルクミン (中)、およびビスデメトキシクルクミン (下) の質量スペクトルの結果。

フラッシュ浄化

TLC で示された分離がそのまま最適であったため、アイソクラティック メソッドを使用しました。 粗物質を25g、15μmの球状シリカゲルカラム(PF-15SIHC-F0025)で精製した。 25 mg の粗重量を 15 mg のシリカゲルに乾式装填し、15 g 乾式装填カートリッジ (PF-DLE-F0025) に装填しました。

図5:ライブテーリング 開発された TLC プレートから得られたフラッシュ クロマトグラム。

ASAPによるフラクション同定®/ CMS

ex expression CMS® ASAP を使用した CMS® Direct Analysis Probe により、LC/MS やサンプルの調整を必要とせずに、化合物を簡単に同定できます。

純粋な画分 (1.1、1.3、および 1.5) は、ASAP を使用して分析しました。® APCI イオン化および正極性 CMS を備えたプローブ。 ただし、クルクミノイドは APCI の正極性と負極性の両方でよくイオン化しますが、(M+H)+ イオンはフラグメンテーションが少ないことを示しました。 検出された質量は、理論上の [M+H] と一致しています。+ m/z 値。

図6:ライブテーリング Advion Interchim Scientific 至急® 直接分析プローブは、ex の APCI 対応イオン源に直接挿入されます。 expression CMS® CMS。

図7:ライブテーリング 分数の質量スペクトル。

精製された画分を濃縮乾固して、それぞれ固体I(14.1mg)、II(5.6mg)およびIII(6.7mg)を得た。これは、53.4%でクルクミン(I)、デメトキシクルクミン(II)、およびビスデメトキシクルクミン(III)を表す。 14.1%、および分離されたクルクミノイド プロファイルの 5.6%。 これらの結果は、報告された文献値と一致しています2.

RP-HPLCによる化合物の純度の確認

図8:ライブテーリング 精製されたフラクション混合物の UV スキャン。

逆相高速液体クロマトグラフィー (RP-HPLC) では、フラッシュ クロマトグラフィー後に化合物の純度を個別に確認できます。 XNUMX つの化合物すべての等量混合物を組み合わせ、Phenomenex Kinetex で実行しました。® 5 μm Biphenyl 100 Å 50 x 2.1 mm カラムで、アイソクラティック ACN:水 (v:v、55:45) と 0.2% ギ酸を使用。 予想どおり、8 つのクルクミノイドの溶出順序が変わり、現在は III、II、および I が溶出しています (図 XNUMX)。 このメソッドを開発した後、それぞれの単一の収集された画分が注入され、純度が分析され、MS 分析によって再度確認されました。

図9:ライブテーリング クルクミン画分 1.1 の UV スキャンと質量スペクトル。

図10:ライブテーリング クルクミン画分 1.3 の UV スキャンと質量スペクトル。

図11:ライブテーリング クルクミン画分 1.5 の UV スキャンと質量スペクトル。

要約

プロセスのさまざまな段階 (TLC プレート識別、フラクション確認、二次純度分析) での TLC クロマトグラフィー、フラッシュ クロマトグラフィー、および質量分析サポートの組み合わせにより、95% を超える確認された純度レベルでウコン粉末からクルクミノイドを精製できます。

参照:
1ジャヤプラカシャ等。 クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミンの抗酸化作用。 食品化学、第 98 巻、第 4 号、2006 年、720 ~ 724 ページ。 ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2プラビーン等。 ウコンに存在するクルクミノイドをプロファイリングするための容易な NMR アプローチ、Food Chemistry、第 341 巻、第 2 部、2021 年、128646、https://doi.org/10.1016/j。 foodchem.2020.128646.

Advion Interchim Scientific SOLATIONを使用した土壌分析® 元素分析用ICP-MS

はじめに

人間または産業活動によって生成された環境汚染物質は、流出水または空気からの堆積物を介して土壌に到達することがよくあります。 これらの汚染物質は植物に取り込まれ、食物連鎖を移動して、人間や動物の健康に重大な影響を与える可能性があります. したがって、健康な植物の成長にとって重要な土壌中の必須栄養素のレベルを監視することが重要であるだけでなく、汚染物質のレベルを監視することも不可欠です.

このアプリケーション ノートでは、SOLATION® 誘導結合プラズマ質量分析計 (ICP-MS)。 未知の土壌サンプルのグループと CRM を EPA 3051a を使用して分解し、メソッド 6020a の要件に従って分析しました。

実験

試薬と材料
• 硝酸(Aristar Plus、微量金属グレード)
• 塩酸(アリスタープラス、微量金属グレード)
• 水、タイプ 1 (18.2 MΩ、Elga ポイント オブ ユース システムまたは同等品)
• NIST CRM2706 「ニュージャージーの土壌、有機物、微量元素」
• Spex 'CL-ICV-1' マルチエレメント ソリューション
• アルミニウム標準溶液 (1000 μg/ml、クラリタス ppt グレード)

計装
1. 5000SVT20 ローターを備えたアントンパール社の Multiwave 50 (20 ポジション、50 bar (40 psi) で通気する 580 mL 容器)
2.OKF高速多機能グラインダー
3. Advion Interchim Scientific SOLATION® 元素分析用ICP-MS

規格

キャリブレーション標準は、分解されたサンプルと同じ酸比率で調製されました (9 mL HNO3+ 3mL HCl、または 3:1)。 3% HNO XNUMX リットル3+ 1% HCl は、標準の希釈液、サンプルの最終希釈液、およびキャリブレーション ブランクとして使用するために作成されました。

標準は、Spex 多元素ソリューション「CL-ICV-1」と単一元素アルミニウム標準を使用して作成されました。 アルミニウムは、土壌中のこの元素の高レベルを考慮して、混合物に個別に追加されました。

サンプルと準備

60 つの土壌サンプルを 3051°C で一晩乾燥させた後、OKF 高速多機能グラインダーを使用して細かく粉砕し、均一な混合物を作りました。 EPA メソッド 0.5a「堆積物、スラッジ、および土壌のマイクロ波による酸分解」に従って、各サンプル 9 g をマイクロ波容器に移し、硝酸 3 mL および塩酸 1 mL と混合しました。 次に、容器に蓋をして、表 50 に概説する方法を使用して分析を行いました。分解後、サンプルをろ過し、脱イオン水で容量を 1.0 mL にしました。 次に、50 mL のアリコートを、最初のサンプル重量に応じて 5,000 倍の公称最終希釈用に調製した希釈液で XNUMX mL の最終容量に希釈しました。

テーブル1: マイクロ波消化プログラム。

QC の目的で、XNUMX つの未知の土壌サンプルをサンプル、複製、およびスパイクとして準備しました。 これらは個別に消化され、最初の XNUMX つはサンプル前処理の再現性を比較するために使用されました。

結果の正確性を検証するために、標準参照物質 NIST 2706「ニュージャージーの土壌、有機物および微量元素」を含めました。これには、この研究で報告されたすべての分析物の認定値が含まれています。

サンプルはSOLATIONを使用して分析されました® ICP-MS。 ザ・ソレーション® この分析の機器構成は、マイクロミストを備えたサイクロン スプレー チャンバーでした。® 同心ネブライザーと一体型トーチ。 Niサンプラーとスキマーコーンは、研究全体で使用されました。 プラズマ動作パラメータは次のとおりです。

テーブル2: プラズマ動作パラメータ。

ICP-MS法

SOLATIONに不可欠® ICP-MS は、多原子イオン、特に遷移金属元素からの干渉に対処するために使用される八重極コリジョン セルです。 堅牢で日常的な微量元素分析では、ドリフトや不要なダウンタイムの原因となる八重極セルの汚染を防ぐことが重要です。 したがって、SOLATION のイオン経路は® ICP-MS は、コリジョン セルがプラズマの直線から外れるように設計されています。 界面を通過するイオンは、90 ̊ ターンを経て方向付けられ、四重極デフレクター (QD) を使用して八重極の入口に集束されます。 光と中性粒子は引き続き QD を通過し、セルから離れます。

SOLATIONのコリジョンセル® ICP-MS は、衝突ガスとして機能する He をセルに充填する「He ガス」モード、またはセルを空にする「ノー ガス」モードで操作できます。 「He Gas」モードは多原子干渉を受ける同位体に使用され、「No Gas」モードは残りの同位体に使用されます。 SOLATION の「He Gas」モードと「No Gas」モードの迅速な切り替え® (< 5 秒) により、分析実行を短く保つことができるため、生産性が向上します。

このアプリケーションで「He ガス」モードに使用されるヘリウム流量は 6 ml/min でした。 表 3 に、この分析に使用した元素とその同位体、およびそれぞれに使用したモードを示します。

テーブル3: このスタディに含まれる元素のリストと、その同位体および分析に使用されたガス モード。

結果と考察

図 1 に要約されている結果は、CRM2706 の測定データとこれらの元素の報告された抽出レベルとの間の優れた一致を示しています。 おそらく、この消化方法の抽出効率のばらつきが原因で、K と Al でわずかに高い回収率が観察されました。

図1: 認定標準物質回収データ。

表 4 に示すように、添加回収率は、Al を除くすべての元素で平均 75% ~ 125% でした。 これは、サンプル中の Al のレベルと比較して、スパイクのサイズが小さいためである可能性があります。 同じ表に含まれているのは、これらの要素の重複消化/分析の結果です。 平均して、重複は 20% 未満の間隔で、ほとんどの要素は 5% 未満の優れた再現性を示しました。

テーブル4: さまざまなサンプルの平均スパイク回収率と重複再現性。

まとめ

このアプリケーションブリーフでは、Advion Interchim Scientific SOLATION を使用した土壌中の微量元素の分析について報告します。® ICP-MS。 スパイクされたサンプルと CRM の両方で優れた回収率が観察されました。 四重極デフレクターと衝突セルの組み合わせにより、ドリフトが最小限に抑えられ、時間の経過とともに精度と精度が保証されます。 報告された方法は、SOLATION の高速コリジョン セル ガス切り替え機能の恩恵を受けます。® 迅速、正確、再現性のある結果を得るために、土壌中の幅広い元素を分析します。

天然物の大量分画コレクション: ウコンおよび緑茶抽出物からの例

フラッシュ:プリフラッシュ® 5.250
質量分析:例 expression CMS® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム
サンプリング:できるだけ早く® プローブ

はじめに

フラッシュクロマトグラフィーは、従来、精製プロセス中の化合物の主な検出方法として UV 吸収を使用してきました。 UV 吸収は多くの種類の化合物に広く適用できますが、混合物中の個々の化合物に対する特異性は限定されており、発色団を持たない種類の化合物は見逃されます。

Mass-directed Fraction Collection では、個々の化合物に固有のイオンに基づく質量分析検出 (MS) に基づいてフラクションを収集し、特定の分子情報を提供できます。 これにより、精製プロセス全体が簡素化され、分離された各化合物のアイデンティティの信頼性が高まります。

ここでは、フラッシュクロマトグラフィーおよび分取 LC 中の質量指向フラクションコレクションにより、緑茶およびウコン粉末から天然物を分離する方法について説明します。 デモンストレーションの目的で、単離された化合物は大気固体分析プローブ (ASAP) によってさらに確認されました。®) MS または HPLC-MS。

クルクミノイドの紹介

クルクミンは、ターメリックの根 (Curcuma longa) に含まれる主要なクルクミノイドです。 栄養補助食品や化粧品の成分、料理の香料、黄橙色の食品着色料として一般的に使用されています。 クルクミノイドには、抗酸化作用と抗炎症作用があることが報告されています。

店頭で購入したウコン粉末(57.3 g)をエタノールで抽出し、ろ紙でろ過し、濃縮しました。 これにより、目的の 6.4 つのクルクミノイドを含む 4 g の粗抽出油が得られました (図 XNUMX の TLC 分析も比較してください)。


図1: 対象のクルクミノイドの構造。


図2:市販のターメリックパウダー。


図3:ウコン粉末から抽出した粗抽出油。


図4: ウコン抽出物 (365:97 DCM:MeOH) の 3 nm での TLC 分析と puriFlash に転送されたメソッドのクロマトグラム® UV検出を使用して5.250。

メソッド開発

ウコン抽出物を最初に TLC プレートで分析し、次にメソッドを puriFlash に移しました。® 5.250 つの波長で UV 検出を使用する 254 システム。 427 nm で XNUMX つの化合物が検出され、XNUMX nm で XNUMX つの推定クルクミノイドが検出されましたが、UV 検出では個々の化合物に対する特異性はありません。

TLC で示された分離が最適であったため、アイソクラティック メソッド (97:3 ジクロロメタン:メタノール) を使用しました。 粗物質を12g、15μmの球状シリカゲルカラム(PF-15SIHC-F0012)で精製した。 12 mg の粗重量を 15 mg のシリカゲルに乾式装填し、15 g の乾式装填カートリッジ (PF-DLE-F0012) に装填しました。 対象化合物ごとに XIC チャネルを使用して画分を収集しました。


図5: パラメータを使用して実行されたフラッシュ クロマトグラフィー メソッドのスクリーンショット。

質量分析計の設定は、InterSoft を通じて制御されます。®puriFlash 上の X ソフトウェア® システム。 質量分析計には APCI ソースが取り付けられ、負イオン化取得モードで実行されました。


図6: クロマトグラフィー実行の質量分析計パラメーターのスクリーンショット。

実験

マスディレクテッドフラクションコレクション

選択した質量対電荷値で観測されたシグナルの強度をプロットすることによって作成された抽出イオンクロマトグラム (XIC)。 これにより、目的の化合物の低ノイズ信号が可能になります。 ここでは、対象の XNUMX つのクルクミノイドを検出するように XIC チャネルが設定されています。


図7: ウコン抽出物の TLC 分析 (97:3 DCM:MeOH) および puriFlash に転送されたメソッドのクロマトグラム® MS XIC 検出を使用した 5.250。




図8: puriFlash によって提供される各ピークの質量スペクトル® インターソフト®X ソフトウェア。

ASAP®® MSフラクションの確認

純粋な画分 (1.1、1.2、および 1.3 と 1.4 を組み合わせたもの) は、ASAP を使用してさらに分析しました。® 負極性 MS。 検出された質量は、理論上の [MH]-m/z 値と一致しています。




図9: 同定と純度を確認する単離された化合物の質量スペクトル。

はじめに、緑茶カテキン

乾燥緑茶は通常、乾燥重量に基づいて 10 ~ 30% のポリフェノールで構成されており、主要な茶ポリフェノールはカテキンで、(-)-エピガロカテキン (EGC)、(-)-エピガロカテキン-3-ガレート (EGCG)、(-) -エピカテキン-3-ガレート (ECG) および (-)-ガロカテキンガレート (GCG)。 EGCG は最も豊富で生物学的に活性なカテキンであり、カテキンを生茶抽出物から分離して精製することで、市場での入手可能性と価値を大幅に高めることができます。

乾燥緑茶葉を熱水抽出し、酢酸エチルで分配し、濾紙で濾過し、蒸発させて粗抽出物を得た。 次いで、乾燥抽出物を7.5mLの水に溶解し、0.2μmフィルターで濾過した後、さらに処理した。


図10:緑茶葉の浸漬。


図11:緑茶に含まれる主要なカテキン。

メソッド開発
HPLC-UV/MS 分析では、茶抽出物中に EGC、EGCG、GCG、EC、および ECG が検出されました (図 12)。

溶剤A:水
溶媒 B: メタノール
UV:275 nm
MS: 150 ~ 900 のフル スキャン
コラム:US15C18HP-250/046


図12: 緑茶抽出物の HPLC-UV クロマトグラム、MS データ、および EGCG の標準を化合物の確認に使用しました (データは示していません)。

質量分析計の設定は、InterSoft を通じて制御されます。®puriFlash 上の X ソフトウェア® システム。 質量分析計に ESI ソースを取り付け、負イオン化取得モードで実行しました。


図13: クロマトグラフィー実行の質量分析計パラメーターのスクリーンショット。

マスディレクテッドフラクションコレクション
ここでは、対象の 4 つのカテキンを検出するように XIC チャネルが設定されています。 EGCG と CGC は異性体であるため、同じ質量を共有します。


図14: puriFlash に転送されたメソッドのクロマトグラム® MS XIC 検出を使用した 5.250。


図15: InterSoft から提供された各ピークの質量スペクトル®X ソフトウェア。

要約

• 天然物を分離する際の最大の課題の XNUMX つは、複雑な抽出混合物中の対象化合物の同定です。
• MS とクロマトグラフィーを連携して使用することで、収集したフラクションをさらに同定する必要なく、高度な純度と精度で複雑な混合物中の化合物を分離および同定できます。
• 収集されたフラクションは、InterSoft によって提供される MS データを介して直接特徴付けることができます。®puriFlash 上の X ソフトウェア® システム。
•プリフラッシュ® 5.250とex expression CMS® CMS は、緑茶に含まれるカテキンやターメリックに含まれるクルクミノイドなどの天然物の精製と同定において強力な役割を果たします。

逆相分取LC-MSによるXNUMXつの市販品及び、処方薬のハイスループット精製

計装:

puriFlash® 5.250
ex expression CMS® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム
上層圏® StrategyTMカラムUS5C18HQ-150 / 300

作成者:

Advion Interchim Scientific、モンリュソン、フランス本社

 

はじめに

精製は医薬品開発における重要なステップです。 研究からスケールアップ、プロセスに至るまで、精製と確認は医薬品を市場に出すための重要なステップです。 精製された化合物の十分な量と再現性のある品質を提供するハイスループットソリューションが不可欠です。 医薬品有効成分(API)とその不純物の分離は、分取クロマトグラフィーシステムを使用して簡単に行うことができます。

このアプリケーションノートでは、カフェイン、グラフェニン、ケトプロフェン、フラボン、フェノフィブラートなどの市販薬(OTC)に含まれる1つの有効成分を、コンパクトな質量分析計を使用した確認付きの分取精製ワークフローで精製します。

図1:ライブテーリング 対象となるXNUMXつの化合物には、カフェイン、グラフェニン、ケトプロフェン、フラボン、およびフェノフィブラートが含まれます。 化学構造と医薬品の使用例を以下に示します。

カフェイン: 刺激効果のある天然化学物質であるカフェインは、錠剤の形で精製されているか、コーヒー、お茶、カカオなどに天然に含まれています。

グラフェニン: 非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)であるグラフェニンは、アナフィラキシーのリスクが高いため、1991年に市場から削除されました。

ケトプロフェン: 処方箋に基づく非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)であるケトプロフェンは、治療に使用されます 炎症、腫れ、こわばり、関節痛。 心臓発作、脳卒中、炎症などの問題のリスクが高まったため、この薬は1995年に中止されました。

フラボン: 植物に一般的に存在する代謝物と殺線虫剤。

フェノフィブラート: 血中の高コレステロールおよびトリグリセリド(脂肪様物質)レベルを低減および治療するために使用される処方薬。

実験

探索的LC分離

図2:ライブテーリング 事前に同定された化合物の存在を確認するために、探索的LC-UV分析により、精製前に薬物化合物の存在が確認されました。

分取LCラン

対象となるXNUMXつの化合物とそれらの溶出ポイントのポジティブIDに続いて、薬物混合物はpuriFlashでの分取LC-UV分析の準備が整いました。® 5.250iELSD。 精製はiELSDパックによって支援され、発色団を含まない化合物の検出を可能にします(図3)。

結果と検証

分離と精製の結果

分離された化合物の同一性は、Advion Interchim Scientificexを使用して確認されました。 expression CMS® コンパクトな質量分析計。目的の化合物をすばやく正確に識別します。

これらの化合物の純度は、分析スケールのHPLCを使用して確認できます。

SOLATION®、大麻および麻中の重金属を検出するための新しいICP-MS

はじめに

大麻と麻の製品ははるかに多くなっています 利用できます を用意しました 薬用および娯楽用 有毒な重金属の定期検査を行う はるかに重要.  Advion InterchimScientificがSOLATIONを紹介します® ICP-MSの の分析 の重金属 大麻植物と大麻製品のサンプル。 大麻に含まれる重金属に関する連邦ガイドラインはありませんが、大麻の使用と生産が合法である州では、 採択 暴露 制限 およびQC基準 ヒ素、カドミウム、水銀用, とリード USP <233>に基づく。 ここでは、結果を報告します サンプル分析のこれらのガイドラインを使用してください。 

メソッド

大麻の花は地元で購入し、分析のために細かく挽いた。 サンプルは、マイクロ波分解システム(CEM Mars 6、マシューズ、ノースカロライナ州)。 メソッドの検証 を用意しました USP <233>は、スパイク回収率、再現性を使用した精度に基づいています レビューに基づき 6つの独立して消化されたレプリケートの%RSD、および堅牢性。これらのXNUMXつのレプリケートは、別のアナリスト、別の機器、または別の日にXNUMX回実行されます。 スパイクレベルは、定義された「アクションレベル」に基づいています by ガイドとしてのカリフォルニアの最大許容日曝露(PDE)制限:鉛0.5 µg / g、ヒ素とカドミウム0.2 µg / g、および水銀0.1 µg / gを使用して、100%スパイクレベルを定義します。 サンプルは、アクションレベルの50%と150%でもスパイクされます。 

予備データ

消化のために、 0.5 g(+/- 0.002g)のサンプルを9mLの濃厚液で処理します。 HNO3および1mL濃度電子レンジ容器内のHClと 反応する 1用5 キャップされる前に。 容器は電子レンジでカルーセルにロードされます そして「ワンタッチ」大麻法、CEMによって提供され、 使用済み。 サンプルは で200°Cに持って来られる 30分、そこで開催 10分、冷まします。 その結果、粒子のない透明な溶液が得られます。 SOLATION® ICP-MSは 分析する サンプル As、Cd、 Hg、およびPb 消化後 と希釈。 ザ 結果 それを示します SOLATION® ICP-MSは正確な値を生成することができました スパイク回収率で測定 それは よく 以内 70〜150%の範囲。  結果 6つの独立したダイジェストから した 以内 の定義された制限 20%RSD。 6つのダイジェストの分析を繰り返します 別の日に 示されました 初期結果との良好な一致 > した 中で 25%RSD仕様. USP <233で定義>。 全体的な結果 SOLATIONが® ICP-MSは効果的です 大麻と麻のサンプルを分析するための機器。