天然物の大量分画コレクション: ウコンおよび緑茶抽出物からの例
フラッシュ:プリフラッシュ® 5.250
質量分析:例 expression CMS® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム
サンプリング:できるだけ早く® プローブ
概要
フラッシュクロマトグラフィーは、従来、精製プロセス中の化合物の主な検出方法として UV 吸収を使用してきました。 UV 吸収は多くの種類の化合物に広く適用できますが、混合物中の個々の化合物に対する特異性は限定されており、発色団を持たない種類の化合物は見逃されます。
Mass-directed Fraction Collection では、個々の化合物に固有のイオンに基づく質量分析検出 (MS) に基づいてフラクションを収集し、特定の分子情報を提供できます。 これにより、精製プロセス全体が簡素化され、分離された各化合物のアイデンティティの信頼性が高まります。
ここでは、フラッシュクロマトグラフィーおよび分取 LC 中の質量指向フラクションコレクションにより、緑茶およびウコン粉末から天然物を分離する方法について説明します。 デモンストレーションの目的で、単離された化合物は大気固体分析プローブ (ASAP) によってさらに確認されました。®) MS または HPLC-MS。
クルクミノイドの紹介
クルクミンは、ターメリックの根 (Curcuma longa) に含まれる主要なクルクミノイドです。 栄養補助食品や化粧品の成分、料理の香料、黄橙色の食品着色料として一般的に使用されています。 クルクミノイドには、抗酸化作用と抗炎症作用があることが報告されています。
店頭で購入したウコン粉末(57.3 g)をエタノールで抽出し、ろ紙でろ過し、濃縮しました。 これにより、目的の 6.4 つのクルクミノイドを含む 4 g の粗抽出油が得られました (図 XNUMX の TLC 分析も比較してください)。
図1: 対象のクルクミノイドの構造。
図2:市販のターメリックパウダー。
図3:ウコン粉末から抽出した粗抽出油。
図4: ウコン抽出物 (365:97 DCM:MeOH) の 3 nm での TLC 分析と puriFlash に転送されたメソッドのクロマトグラム® UV検出を使用して5.250。
メソッド開発
ウコン抽出物を最初に TLC プレートで分析し、次にメソッドを puriFlash に移しました。® 5.250 つの波長で UV 検出を使用する 254 システム。 427 nm で XNUMX つの化合物が検出され、XNUMX nm で XNUMX つの推定クルクミノイドが検出されましたが、UV 検出では個々の化合物に対する特異性はありません。
TLC で示された分離が最適であったため、アイソクラティック メソッド (97:3 ジクロロメタン:メタノール) を使用しました。 粗物質を12g、15μmの球状シリカゲルカラム(PF-15SIHC-F0012)で精製した。 12 mg の粗重量を 15 mg のシリカゲルに乾式装填し、15 g の乾式装填カートリッジ (PF-DLE-F0012) に装填しました。 対象化合物ごとに XIC チャネルを使用して画分を収集しました。
図5: パラメータを使用して実行されたフラッシュ クロマトグラフィー メソッドのスクリーンショット。
質量分析計の設定は、InterSoft を通じて制御されます。®puriFlash 上の X ソフトウェア® システム。 質量分析計には APCI ソースが取り付けられ、負イオン化取得モードで実行されました。
図6: クロマトグラフィー実行の質量分析計パラメーターのスクリーンショット。
実験
マスディレクテッドフラクションコレクション
選択した質量対電荷値で観測されたシグナルの強度をプロットすることによって作成された抽出イオンクロマトグラム (XIC)。 これにより、目的の化合物の低ノイズ信号が可能になります。 ここでは、対象の XNUMX つのクルクミノイドを検出するように XIC チャネルが設定されています。
図7: ウコン抽出物の TLC 分析 (97:3 DCM:MeOH) および puriFlash に転送されたメソッドのクロマトグラム® MS XIC 検出を使用した 5.250。
図8: puriFlash によって提供される各ピークの質量スペクトル® インターソフト®X ソフトウェア。
ASAP®® MSフラクションの確認
純粋な画分 (1.1、1.2、および 1.3 と 1.4 を組み合わせたもの) は、ASAP を使用してさらに分析しました。® 負極性 MS。 検出された質量は、理論上の [MH]-m/z 値と一致しています。
図9: 同定と純度を確認する単離された化合物の質量スペクトル。
はじめに、緑茶カテキン
乾燥緑茶は通常、乾燥重量に基づいて 10 ~ 30% のポリフェノールで構成されており、主要な茶ポリフェノールはカテキンで、(-)-エピガロカテキン (EGC)、(-)-エピガロカテキン-3-ガレート (EGCG)、(-) -エピカテキン-3-ガレート (ECG) および (-)-ガロカテキンガレート (GCG)。 EGCG は最も豊富で生物学的に活性なカテキンであり、カテキンを生茶抽出物から分離して精製することで、市場での入手可能性と価値を大幅に高めることができます。
乾燥緑茶葉を熱水抽出し、酢酸エチルで分配し、濾紙で濾過し、蒸発させて粗抽出物を得た。 次いで、乾燥抽出物を7.5mLの水に溶解し、0.2μmフィルターで濾過した後、さらに処理した。
図10:緑茶葉の浸漬。
図11:緑茶に含まれる主要なカテキン。
メソッド開発
HPLC-UV/MS 分析では、茶抽出物中に EGC、EGCG、GCG、EC、および ECG が検出されました (図 12)。
溶剤A:水
溶媒 B: メタノール
UV:275 nm
MS: 150 ~ 900 のフル スキャン
コラム:US15C18HP-250/046
図12: 緑茶抽出物の HPLC-UV クロマトグラム、MS データ、および EGCG の標準を化合物の確認に使用しました (データは示していません)。
質量分析計の設定は、InterSoft を通じて制御されます。®puriFlash 上の X ソフトウェア® システム。 質量分析計に ESI ソースを取り付け、負イオン化取得モードで実行しました。
図13: クロマトグラフィー実行の質量分析計パラメーターのスクリーンショット。
マスディレクテッドフラクションコレクション
ここでは、対象の 4 つのカテキンを検出するように XIC チャネルが設定されています。 EGCG と CGC は異性体であるため、同じ質量を共有します。
図14: puriFlash に転送されたメソッドのクロマトグラム® MS XIC 検出を使用した 5.250。
図15: InterSoft から提供された各ピークの質量スペクトル®X ソフトウェア。
まとめ
• 天然物を分離する際の最大の課題の XNUMX つは、複雑な抽出混合物中の対象化合物の同定です。
• MS とクロマトグラフィーを連携して使用することで、収集したフラクションをさらに同定する必要なく、高度な純度と精度で複雑な混合物中の化合物を分離および同定できます。
• 収集されたフラクションは、InterSoft によって提供される MS データを介して直接特徴付けることができます。®puriFlash 上の X ソフトウェア® システム。
•プリフラッシュ® 5.250とex expression CMS® CMS は、緑茶に含まれるカテキンやターメリックに含まれるクルクミノイドなどの天然物の精製と同定において強力な役割を果たします。