puriFlash® 5.250 PrepLC および ex を使用した複雑な混合物からの生理活性ペプチドの精製 expression CMS® CMS検出器

セットアップ
マススペック: ex expression CMS^® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム
フラッシュ： puriFlash^® 5.250 分取LC
HPLC： AVANT^®

著者
チャントン・ハオ
Advion Interchim Scientific

概要
近年、バイオ医薬品企業は、従来の小分子薬と比較して特異性と選択性が強化されたペプチド/タンパク質ベースの薬剤を採用することが増えています。 ただし、創薬プロセスにおけるペプチド/タンパク質の精製は、最終製品の安全性と有効性を確保するために非常に重要です。 生物活性のある標的化合物の可能な限り最高の純度レベルを達成することは、毒性のリスクを最小限に抑え、規制基準に準拠するために不可欠です。^【1,2]

チーズ製造の副産物であるホエイタンパク質単離物には、さまざまなグリコマクロペプチドと 6757 つの重要な生理活性ペプチド、分子量 (MW) 6787 Da のカゼイン マクロペプチド A (CMP) と MW XNUMX Da のカゼイン マクロペプチド B (CMPb) が含まれています。 。 カゼインなどの個別成分の抽出・精製
マクロペプチドは、その生物活性を調べるために不可欠です。^【3]

このアプリケーション ノートでは、例としてホエータンパク質単離物と XNUMX つのカゼイン マクロペプチドを使用して、puriFlash で構成されるシステムを使用した生物活性成分の単離と精製を実証します。^® 5.250 prepLC がオンラインで元に接続 expression CMS^® CMS検出器。 この組み合わせにより、生物活性のある標的ペプチドやタンパク質に効果的に反応しない可能性がある UV や ELSD などの従来の検出器と比較して、より高い選択性と感度が得られます。

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puriFlash^® 5.250

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ex expression CMS^® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム

方法
ホエイプロテインアイソレートの調製
• このアプリケーションで使用されるカゼイン マクロペプチドの単離手順は、斉藤忠夫の研究に基づいています。^【4] いくつかの変更を加えて。
• 地元の食料品店から購入したホエータンパク質単離物のサンプル 50 g を、500% 水と 70% メタノール (v/v) の溶媒混合物 30 mL と混ぜ合わせました。 混合物を７０℃で９０分間超音波処理し、次いで減圧濾過した。
・ロータリーエバポレーターを使用して減圧下、４０℃でメタノールを除去することにより、得られた濾液を３００ｍＬの体積まで濃縮した。 次いで、それを４℃で１時間保管した。 続いて、等量の冷エタノールを溶液に添加し、混合物を５分間ボルテックスしてから、４℃でさらに４時間保存した。
・混合物を０．５μｍフィルターを使用して減圧濾過した。 次いで、減圧下でロータリーエバポレーターを使用して、最終濾液を５０ｍＬの体積まで濃縮した。
• 濃縮抽出物の 100 μL アリコートを 900 μL の脱イオン (DI) と混合しました。
分析用 HPLC/MS 分析用の水。
• 残りの濾液は、puriFlash を使用したペプチド精製に使用されました。^® 5.250 PrepLC システムと ex を組み合わせたシステム expression CMS^® CMS検出器。

表1： 分析 HPLC/MS メソッドのセットアップ

分析 HPLC/MS メソッドのセットアップ
ホエイプロテイン単離物からの液体抽出物は、AVANT を使用して最初に分析されました。^® HPLC/CMS システムおよび使用した 4.6 mm カラム用に開発されたクロマトグラフィー分離メソッド (表 1)。

図 1a は、液体抽出物の HPLC/MS クロマトグラムを示しています。 6.44 分のピークからの平均 MS スペクトルは、化合物が少なくとも XNUMX つの質量を持つ多重荷電ペプチドであることを示しています。 m / z 755.2、849.4、970.6、1132.1、および 1358.6 (図 1b) が充電プロファイルを形成します。

ソフトウェア電荷デコンボリューションにより、ペプチドの非電荷質量は 6787.4 Da であると決定され、これはカゼイン マクロペプチド B (CMPb、理論質量 6787 Da) であることを示しています (図 1c)。

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AVANT^® （U）HPLC

図1： (a) ホエータンパク質単離物からの液体抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、(b) RT 6.44 分のピークからの平均 MS スペクトル、(c) RT 6.44 分のペプチド溶出ピークのデコンボリューションされた非荷電質量。

図2： (a) ホエータンパク質単離物からの液体抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、(b) RT 11.02 分のピークからの平均 MS スペクトル、(c) RT 11.02 分で溶出するペプチドのデコンボリューションされた非荷電質量。

11.02 分で溶出するピークから得られた平均 MS スペクトルは、この化合物が、その電荷プロファイルを形成する m/z 751.5、845.4、966.1、1126.8、および 1352.1 の質量を持つ多重荷電ペプチドでもあることを示唆しています (図 2b)。

同様に、電荷デコンボリューションにより、このペプチドの非荷電質量は 6755.3 Da であると決定され、理論的質量が 6755 Da であるカゼイン マクロペプチドの A 変異体、CMP を示します (図 2c)。

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puriFlash^® 5.250、MS スプリッターおよび元 expression CMS^® と組み合わせた、シンプルで高性能なLC / MSシステム

PrepLC/MS クロマトグラフィー
次のステップでは、分析分離メソッドをカラム ID 4.6 mm からカラム ID 30 mm までのより大きな分取スケールに置き換え、puriFlash での XNUMX つの CMP (カゼイングリコマクロペプチド) の精製用にさらに最適化しました。^® 5.250 PrepLC/Flash システムをオンラインで元に接続 expression CMS^® CMS検出器。

ホエータンパク質分離物の PrepLC-UV/MS クロマトグラムを図 3 に示し、パラメーターを表 2 に示します。

分画収集は、より高い選択性と感度のために選ばれた MS シグナルに基づいて開始されました。 970〜971 DaのXICをCMPbの検出に使用し、965〜966 DaのXICをCMPの検出に使用しました。

画分１１〜１７と画分１８〜２２の組み合わせ中の有機溶媒を、負圧下でロータリーエバポレーターを使用して除去し、残った水性溶媒を除去した。
ＬＡＢＣＯＮＣＯ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ２．５Ｌ（−５０℃）凍結乾燥機を使用して溶液を乾燥させ、それぞれ１０ｍｇの乾燥収集物を得た。その後、これをその後のＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析のために１０ｍｌの脱イオン水に溶解した。 純度分析の結果を図 2.5 および 50 に示します。

表2： PrepLC/MS メソッドのセットアップ

図3： XNUMX 種類のホエータンパク質単離物の PrepLC-UV/MS クロマトグラム

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CMPbの純度分析
プールした画分 11 ～ 17 の CMPb の純度分析を図 4 に示します。MS 分析では、970.8、1132.3、1358.6、1968.2 の m/z で 4 つの主要なイオンが検出されたことが示されています (図 XNUMXb)。

図 4b の平均質量スペクトルにより、5.94 分のピークの非荷電質量は 6788.4 と決定されました (CMPb、図 4c)。 ただし、MS 分析では、6758.3、6773.5、6804.8、および 6868.4 Da の XNUMX つの微量成分も検出できます。

得られた CMPb の UV 純度は 86.7% (図 4d) ですが、追加の MS データに基づくと、化合物の純度は実際にはそれよりも低くなります (推定 80%)。

分析実行の UV 分析に基づいて、プールされた画分 18 ～ 22 の CMPa は 94.7% と測定されました (図 5a)。

デコンボリューションされた非荷電質量分析では、CMP の予想主要質量 6756.2 (図 5b) と、CMP の酸化型である 6774.6 の XNUMX つの微量成分が示されています。

繰り返しますが、この例は、ペプチドやタンパク質などの生理活性化合物の MS 検出の価値と、UV と比較して MS 検出の優れた特異性を示しています。

図4： (a) 11 ～ 17 のプールされた画分の HPLC-MS クロマトグラム、(b) RT 5.94 分で溶出するピークの平均 MS スペクトル、(c) (b) からの非荷電質量、(d) プールされた画分の HPLCUV クロマトグラム11-17の。

図5： (a) 18～22 のプールされた画分の HPLC-UV クロマトグラム。 (b) CMPa のデコンボリューションされた非荷電質量。

最終的な全体的な純度は約 90 % と推定されます。 XNUMX% は、創薬における生物活性分子としては優れた値です。

収率は犠牲になりますが、選択的分画を使用すると純度をさらに向上させることができます。 たとえば、CMP のフラクション 20 の HPLC-UV/MS 分析 (図 6a) では、UV 純度が 99.0% (図 6d) であり、MS 分析では酸化副生成物が存在しないことが示されています。

図6： (a) フラクション 20 の HPLC-MS クロマトグラム、(b) RT 5.71 分のピークの平均 MS スペクトル、(c) デコンボリューションした CMPa の非荷電質量、(d) フラクション 20 の HPLCUV クロマトグラム。

まとめ
puriFlash^® 5.250 PrepLC/Flash システム、オンラインで ex と結合 expression CMS^® CMS 検出器は優れた性能を実現し、複雑なマトリックスからの生理活性マクロペプチドの選択的精製を高い信頼性で容易にします。 UV または ELSD 検出器と比較して、質量分析計は優れた選択性と感度を実現します。

このアプローチの応用例では、カゼイン グリコール マクロ ペプチドを単離し、合わせた分画を通じて 80% (CMPb) ～ 90% (CMPa) の範囲の純度を高収率で得ることができます。 選択的画分を使用すると、最大 99.0% までのさらに高い純度を達成できます。

 

参考文献

^【1]グラスランド、S.、他。 （2008年）。 タンパク質の生産と精製。 Nature Methods、5(2)、135-146。
^【2]バイオ医薬品の加工: 製造プロセスの開発、設計、実装。
^【3]リン・T.ら(2021) 牛乳中の生物活性物質: 化学、技術、および応用 栄養レビュー v79(S2):48–69
^【4]斉藤 哲也(1991) スイートチーズホエーからのカゼイノグリコペプチドの新しい単離方法。 J. デイリー サイエンス74、2831-2837