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黒米中のシアニジン-3-グルコシドの抽出、同定、精製および定量

科学専用、あなた専用

セットアップ
フラッシュ： puriFlash® 5.250、XS-Vap®
マススペック: ex expression CMS® コンパクト質量分析計（CMS）
HPLC： アバント™

概要
米は世界、特にアジア諸国において最も重要な食品の一つです。 色素のある米の品種の中でも、黒米はその高い栄養価と有益な健康特性によりますます注目を集めています。 黒米は、シアニジン-3-グルコシド（Cyn-3-Glu）、シアニジン-3-ルチノシド（Cyn-3-Rut）、ペオニジン-3-グルコシド（Pn-3-Glu）などを含むアントシアニンが豊富な色素米です。アントシアニン。 シアニジン-3-グルコシドは、黒米に含まれる主なアントシアニンです。

このアプリケーション ノートでは、シアニジン-3-グルコシドがどのように黒米から抽出され、prepLC/Flash システムで精製されるかを示します。 Cyn-3-Glu の量と純度は、認定された参照標準を利用して測定されます。

方法
シアニジン-3-グルコシド抽出
黒米は地元の食料品店から購入し、スパイスグラインダーで細かい粉末に粉砕し、次の方法で抽出しました。
1. 30 グラムの粉砕黒米を、200 N HCl (1.0:85、v/v) で酸性化したメタノール 15 mL と混合し、15 分間超音波処理しました。
2. 混合物を 7500 rpm、4℃で 5 分間遠心分離しました。 上清をきれいなフラスコにデカントした。 ペレットを、１．０Ｎ ＨＣｌ（８５：１５、ｖ／ｖ）で酸性化したメタノール２００ｍｌで再度抽出し、１５分間超音波処理した。
3. 25 つの抽出からの上清を合わせ、ロータリーエバポレーターを使用して XNUMX ml に減らしました。
4. 濃縮抽出物の少量を HPLC/UV/MS 分析用に水で 10 倍に希釈し、残りを直接 PrepLC/Flash システムにロードして精製しました。

分析用 HPLC/UV/MS セットアップ
表1： 黒米抽出物の分析 HPLC/UV/MS メソッド。

黒米抽出物の分析 HPLC/MS 分析
黒米の濃縮抽出物を、HPLC/CMS 分析のために蒸留水で 10 倍に希釈しました。

質量範囲が 200 ～ 800 Da の HPLC/MS クロマトグラムを図 1a に示します。 12.10 分のピークからの平均 MS スペクトルを図 1b に示します。 m / z 449.2 はポジティブ ESI モードで検出されました。 ソース内 CID を使用した MS スペクトルを図 1c に示します。 m / z 287.0

図1： A)。 黒米抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、B)。 12.10 分のピークの平均質量スペクトル、C)。 12.10V でのソース内 CID での 30 分のピークの平均質量スペクトル。

MSスペクトルデータベース検索
Advion Data Express の MS スペクトル データベース検索により、12.1 分で溶出された化合物はシアニジン-3-グルコシド (Cyn-3-Glu) であることが確認されます。

図2： 図 1c の平均 MS スペクトルのライブラリ検索結果の抜粋。

Peak Express ソフトウェアは他のアントシアニンの検出に役立ちます
Data Express に実装された Peak Express™ ソフトウェアは、検出されるすべてのイオンの強度の変化率と標準偏差を動的に決定し、事前に設定されたしきい値設定を超えるイオンのみを表示できます。

Peak Express™ は、TIC クロマトグラム (図 14.41a) ではほとんど示されていない、ΔIC クロマトグラム (図 3b) の 3 分の別のピークの検出に役立ちます。 ソース内 CID を使用した ΔS デルタ スペクトルは、m/z 463.3 および 301.1 で検出された XNUMX つのイオンを示しています。

MSスペクトルデータベース検索により、ペオニジン-3-O-グルコシドであることが判明しました（検索結果を図4に示します）。

図3： A)。 黒米抽出物の HPLC/MS クロマトグラム、B)。 黒米抽出物のΔIC クロマトグラム C)。 14.41V でのソース内 CID での 30 分のピークの ΔS デルタ スペクトル

図4： 図 3c の ΔS デルタスペクトルのライブラリ検索結果

黒米抽出物の HPLC/UV 分析
黒米抽出物も HPLC/UV で分析しました。 3 分の Cyn-12.01-Glu の 278 つの特徴的な UV 吸収ピークが 518 nm と 5 nm に見られます (図 XNUMXb)。

PrepLC/Flash システムによる精製では、520 nm を使用してフラクション収集が開始されます。

図5： A)。 黒米抽出物の HPLC/UV クロマトグラム、B)。 12.07 分のピークからの UV 吸光度プロファイル

cyn-3-glu 精製のための PrepLC メソッド
表2： Cyn-3-Glu 精製のための PrepLC メソッド

精製
黒米抽出物の精製は Advion Interchim Scientific puriFlash で実行されます® 5.250 PrepLC/フラッシュ システム。

溶媒と分離方法の詳細情報は方法表に記載されています。 黒米抽出物 (3 ml サンプル) の典型的な PrepLC/UV クロマトグラムを図 6 に示します。

収集された各画分はさらに HPLC-UV/MS で分析され、同定が確認され、追加の純度分析が行われます。

図6： puriFlash 上の黒米抽出物の prepLC クロマトグラム (520 nm)® 5.250 PrepLC/フラッシュシステム

フラクション 2、5、および 8 の HPLC/UV 分析
すべての画分を HPLC/UV/MS で分析します。 画分 1 の HPLC/MS 分析では、m/z 611 の不純物と、Cyn-3-Glu の低い UV 応答が示されました。 フラクション 2 ～ 8 の純度は 97.6 % 以上です。 フラクション 2、5、および 8 の HPLC/UV クロマトグラムは、図 7 に示す例として使用されており、純度 97.6 は 2%、フラクション 100 および 5 は 8% です。

最初の画分を除いて、すべての画分を乾燥のために合わせた。 画分の乾燥は Advion Interchim Scientific puriFlash で実行されました。® 室温での XS-Vap システム。 3 g の黒米から精製された Cyn-30-Glu の重量は 25.8 mg です。

図7： 画分 a) 画分 2、b) 画分 5、c) 画分 8 の HPLC/UV クロマトグラム。

HPLC/UV による C3G の定量
乾燥サンプルの最終純度を確認するために、Cyn-3-Glu の認定参照標準を使用して乾燥 Cyn-3-Glu の定量分析を行い、その純度を確認しました。 Cyn-3-Glu リファレンスの HPLC 検量線を図 8 に示します。

Cyn-3-Glu の測定量は 25.5 mg、純度は 99.0% です。

図8： Cyn-3-Glu 参照標準の HPLC/UV 検量線

まとめ
開発された HPLC/UV/MS および PrepLC メソッドを使用すると、黒米抽出物中の Cyn-3-Glu を分離、精製、定量することができます。

25.5 mg の Cyn-3-Glu が 30 g の黒米から純度 99.0% で精製されました。
Interchim PrepLC/Flash と Advion HPLC-UV/CMS の組み合わせは、米サンプルまたは Cyn-3-Glu を含むサンプルから Cyn-3-Glu を抽出および精製するためのシンプルでコスト効率の高いソリューションです。

この一般的なワークフローに従います。

HPLC/CMS は、天然物精製における標的化合物の同定と純度分析のための簡単な方法を提供します。