控制系统
质谱： 前任expression^® 紧凑型质谱仪（CMS）
HPLC：前卫^®

介绍

寡核苷酸由于其独特的优势而在生物制药领域受到广泛关注。
调节基因或蛋白质表达的能力。 随着几种基于寡核苷酸的药物获得批准或进入临床试验，他们的临床成功是显而易见的。^[1] 这些药物包括反义寡核苷酸、小干扰 RNA (siRNA) 疗法和基于 mRNA 的疫苗，新冠肺炎 (COVID-19) 疫苗的成功开发就是例证。 这些成就激发了人们对寡核苷酸研究和开发的进一步兴趣和投资。

固相合成是生产寡核苷酸序列的常用方法。 原材料通常通过各种技术进行纯化，例如脱盐、超滤、固相萃取 (SPE)、高效液相色谱 (HPLC) 或制备型液相色谱 (prepLC)，具体取决于所需的纯度水平。 离子对 HPLC 或 prepLC 方法通常是首选，因为与其他技术相比，它们可提供更高的纯度。

本应用说明旨在演示多种寡核苷酸样品的 HPLC/UV 分析，并利用 HPLC/CMS 分析确定其分子量。

付款方式

HPLC-UV/CMS系统
借助四元泵和色谱柱选择阀，在不同缓冲液和色谱柱之间进行各种分析的切换过程变得非常简单，无需手动操作
拆下色谱柱并更换溶剂。 这种自动化极大地提高了分析过程的效率和便利性。

Oligo(dT) 12-18 引物
使用 Oligo(dT) 12-18 引物（Thermos Fisher Scientific，MA）检查寡核苷酸分析的 HPLC 方法。

这些 Oligo(dT) 12-18 引物的分离是使用离子对反相 HPLC 方法和 Interchim Uptisphere Strategy 5 μm C18HQ 色谱柱 250 x 4.6 mm 进行的。 所有分析均注入 10 μL 等分试样，柱温保持在 30°C。 流动相 A 的组成为 100 mM TEAA 水溶液，而流动相 B 为乙腈。 流速为1ml/min。

HPLC 分析进行如下：注入样品后，将流动相 B 设置为 10%，持续 1 分钟。 然后在 15 分钟内线性增加到 24%。 在 25.1 分钟时，它增加到 95%，并在此水平保持 2.4 分钟以清洗色谱柱。 随后，在 27.6 分钟时，其减少至 10%，并维持 2.4 分钟以进行柱平衡。

图 1 说明 HPLC 方法有效分离了 12 个 Oligo(dT) 18 至 XNUMX 引物。

含 4 种成分的 RNA 标准品
RNA 寡核苷酸混合物（Aglient Technologies，CA）在 HPLC 分析之前用去离子水稀释 10 倍来制备。 四种RNA标准品的序列如下：14 mer（CACUGAAUACCAAU）、17 mer（UCACACUGAAUACCAAU）、20 mer（UCAUCACACUGAAUACCAAU）和21 mer（GUCUCAUCACACUGAAUACCAAU）。

这些 RNA 样品的分离使用与oligo(dT)12-18 引物类似的 HPLC 方法进行，但略有修改。

HPLC 分析进行如下：注入样品后，将流动相 B 设置为 9%，持续 1 分钟。 然后在 10 分钟内线性增加到 24%。 在 25.1 分钟时，它增加到 95%，并在此水平保持 2.4 分钟以清洗色谱柱。 随后，在 27.6 分钟时，其减少至 9%，并维持 2.4 分钟以进行柱平衡。

图 2 说明 HPLC 方法可以有效分离四种 RNA 样品，即使 1 聚体和 20 聚体 RNA 样品之间存在 21 聚体差异。 20 聚体和 21 聚体的基线分离对于分析合成寡核苷酸至关重要，因为合成过程中的大多数杂质通常为 N=1 聚体或 N+1 聚体。^[2]

单链DNA样本
还使用用于 RNA 样品的改进 HPLC 方法测试了具有 17 mer (GTCAGCAAGGACATCGT)、18 mer(CATTTGAGTAGCCAACGC) 和 19 mer (GGACACTTTCATGCGAGTT) 的三个单链 DNA 样品 (ssDNA)。

每个 ssDNA 的浓度为 30 μM，将 10 μL 等份上样到柱上进行分析。 使用以下梯度进行 HPLC 分析：样品注射后，流动相 B (MPB) 设置为 9%，持续 1 分钟，然后在 15 分钟内线性增加至 24%。 在 25.1 分钟时，它增加到 95%，并在此水平保持 2.4 分钟以清洗色谱柱。 27.6 分钟时，MPB 降至 9%，并维持该水平 2.4 分钟以进行柱平衡。 分析的流速设置为1.5ml/min。 尽管与 RNA 样品相比，每分钟溶剂 B 的变化更大，但图 3 表明该方法以良好的基线分辨率有效分离了三个 ssDNA 样品。

单链 DNA 样品的纯度分析
采用与图 3 所示的 ssDNA 样品相同的方法，也可用于 ssDNA 样品的纯度分析：19 mer (5'-TGGCGGGCGTACCTGGACT-3')。

图 4 显示，使用 Advion Data Express 软件测定的 19 聚体 ssDNA 4 在 74.3 nm 处的 UV 纯度为 260%。

F.5 纯度分析中使用的 ssDNA 样品的 MS 分析
使用 Advion AVANT 进行寡核苷酸的 HPLC/MS 分析^® 与 Advion Ex 结合的 HPLC 系统expression^® CMS-L。 对于 MS 分析，使用尺寸为 2.6 x 18 mm 的 Interchim Uptisphere Strategy 50 μm C2.1-HQ 色谱柱，流速为 0.2 ml/min。 柱温设定为55℃。

与使用 TEAA 进行寡核苷酸质量分析相比，结合 TEA 和 HFIP 的离子对试剂可显着提高性能。 因此，本应用笔记将重点介绍如何使用 TEA 和 HFIP 离子对试剂对寡核苷酸进行 HPLC/MS 分析。

流动相由 15 mM TEA 和 10 mM HFIP 水溶液（作为流动相 A）和甲醇（作为流动相 B）组成。总 HPLC 运行时间为 25 分钟，从 5% 溶剂 B 开始 1 分钟。
然后 B 的百分比在 6 分钟内增加至 14%，随后在 95 分钟增加至 15.1%，并保持 2.9 分钟以洗脱感兴趣的化合物。 随后，将 % B 降低至 5%，并在此水平保持 6.9 分钟，以便在下一次分析之前平衡色谱柱。

MS 分析在负 ESI 模式下进行，MS 扫描范围设置为 500 至 2000 Da。 图 5b 显示了 ssDNA-4 的 MS 谱图，显示带电包络，峰位于 m/z 1463.9 (4-)、1170.8 (5-)、(975.8 (6-)、936.0 (7-)、731.8 (8-) ) 和 650.2 (9-)。通过 Data Express 中的电荷解卷积，确定 ssDNA 样品的不带电质量为 5861.8 Da，这与理论值 5860.8 Da 非常吻合。

另一个示例样品的 MS 分析
ssDNA-5 (5'-GGG-TGG-CAT-TATGCT-GAG-T-3') 的 MS 谱如图 6 所示，显示带电包络，峰位于 m/z 1477.8(4-)、1182.1( 5-)、984.7(6-)、843.8(7-) 和 738.2(8-)。 通过电荷解卷积，确定 ssDNA-5 的不带电质量为 5913.9，这与理论值 5914.9 非常一致。

结论

事实证明，使用 5 μm 粒径的 C18HQ 色谱柱与 TEAA（醋酸三乙铵）离子对试剂结合是寡核苷酸 HPLC 分析的合适解决方案。

对于寡核苷酸的 MS 分析，可以使用相同的 C18HQ 色谱柱，将 HFIP（六氟异丙醇）和 TEA（三乙胺）作为离子对试剂与 AVANT 结合使用^® HPLC-UV/CMS 系统。 该方法已被证明可以对寡核苷酸进行额外的精确质量测量。

总体而言，将 Interchim C18HQ 色谱柱和适当的离子对试剂与 AVANT 结合使用^® HPLC-UV和-CMS系统可以为寡核苷酸的纯度分析和表征提供可靠的解决方案。

参考资料
^[1]Roberts, TC、Langer, R. 和 Wood, MJA 寡核苷酸药物输送方面的进展。 自然修订药物发现 2020, 19, 673–694
^[2]玛蒂娜·C.等人寡核苷酸：合成、表征和纯化的当前趋势和创新应用，Biotechnology J. 2020, 1900226

介绍

碘海醇是一种广泛使用的非离子成像剂，可提高 X 射线分析的对比度。 其低渗透压允许通过肾脏快速清除，防止重吸收和进一步代谢^[1]. 与其他显像剂相比，这使得碘海醇成为一种具有更好安全性的化合物^[2]. 

在许多临床成像应用中，成像剂/造影剂被施用于患者以提高扫描的对比度和空间分辨率。 由于显像剂的毒副作用，其已知浓度的制剂及其纯度分析对其安全使用和准确诊断非常重要。 

在本应用简报中，介绍了一种用于碘海醇分析的简单而准确的 HPLC-CMS 方法。

付款方式

方法设置

应用中使用的所有溶剂均为 HPLC 级。

两种碘海醇标准品购自 Sigma Aldrich。

一种是纯度为 99.99% 的有证标准物质，第二种标称纯度≥ 95%。

所有实验均在 Advion Interchim Scientific ex 上进行expression^® 紧凑型质谱仪与 AVANT™ UHPLC 系统联用，其参数如表 1 所示。

表1: HPLC/MS 方法

碘海醇的 HPLC/UV/MS 分析

在室温下，碘海醇会异构化，在其 HPLC/UV/MS 分析中检测到两个峰。 

这两个峰（图 1A）来自苯胺 N-乙酰基的受阻旋转，这是由于碘海醇的中心苯环上附着的庞大碘原子所致。 这两种化合物本质上是“旋转异构体”，在室温下在水溶液中缓慢交换。

两个峰均通过 MS 分析确认，在 821.9 处显示相同的 m/z（图 1B 和 1C），并且在它们的源内 CID 质谱中没有可见差异（图 2A 和 2B）。 

由于这两种旋转异构体都有助于化合物在 X 射线分析中的毒性和成像增强能力，因此两个峰的总和将用于本应用简报中任何进一步的碘海醇分析。 

图1：(A) 碘海醇的 HPLC 色谱图 (254 nm)，(B) 质子化碘海醇的提取离子色谱图，m/z 821.8，(C) 室温 4.06 分钟处峰的平均 MS 谱图。

图2：(A) RT 3.61 分钟处峰值的平均源内 CID 质谱，(B) RT 4.06 分钟处峰值的平均源内 CID 质谱。

通过 HPLC/UV 分析进行纯度测定

通过将碘海醇样品的 HPLC 响应与相似浓度的碘海醇认证标准品的响应进行比较，样品与认证标准品的峰面积比可以提供快速的浓度和纯度分析。 

碘海醇浓度比的计算公式如下：

碘海醇样品和认证参比样品的 HPLC 色谱图如图 3A 和 3B 所示。

碘海醇样品的两个峰面积之和的平均值为 714（图 3A），碘海醇参考标准品为 740（图 3B）。 经浓度比计算，计算出样品中碘海醇的浓度为0.0964 mg/ml，纯度为96.4%，符合产品标称纯度≥95%。

图3: (A) 碘海醇样品 (254 mg/ml) 的 HPLC 色谱图 (0.1 nm) (B) 碘海醇参考标准品 (254 mg/ml) 的 HPLC 色谱图 (0.1 nm)。

通过 HPLC/UV 分析进行定量

为了更准确地检查碘海醇样品的纯度，使用 25 至 500 μg/mL 的五个不同稀释水平和每个浓度三次重复进样创建了碘海醇认证标准物质的校准曲线。 所得线性校准函数的 R 平方值为 0.9999（图 4），显示出出色的线性度。 

通过碘海醇校准曲线法，确定碘海醇样品的纯度为 97.5%。 

该值也恰好高于样品的最低 95% 的规定纯度，并且与碘海醇样品与碘海醇参考标准的直接 UV 响应比分析的测量值仅相差 1.1%。

如果有经过认证的参考标准物质，通过校准函数或直接 UV 响应比分析的纯度测定都可用于具有 UV 吸光度的有机化学品。

校准函数方法将提供更准确的测量。

图4: 碘海醇的 HPLC 色谱图 (254 nm) 校准曲线

结论

Advion Interchim Scientific AVANT™ (U)HPLC 系统可以为成像剂的纯度分析提供准确的色谱方法，如碘海醇所示。 将 UHPLC 与 Advion Interchim Scientific ex 联用expression^® 紧凑型质谱仪不仅通过其质量和 源内碎裂模式，还可以快速测定杂质。 

参考文献：
^[1] T. Almen，非离子造影剂的开发。，投资。 放射线。 (1985) 调查放射学。 1985, 20(1), S2-S9。
^[2] RD Moore、EP Steinberg、NR Powe、RI White、JA Brinker、EK Fishman、SJ Zinreich、CR Smith，高渗透压造影剂引起的不良反应的频率和决定因素。放射学。 1989, 170, 727-32。