天然产物的质谱定向馏分收集:以姜黄和绿茶提取物为例

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闪光灯:puriFlash® 5.250
质谱:前expression® CMS
采样:尽快® 探测器

介绍

传统上,快速色谱法使用紫外吸收作为纯化过程中检测化合物的主要方法。 虽然 UV 吸收广泛适用于许多类别的化合物,但它对混合物中的单个化合物的特异性有限,并且遗漏了不携带发色团的化合物类别。

质量定向馏分收集使用户能够基于质谱检测 (MS) 收集馏分,质谱检测基于单个化合物特有的离子,并提供特定的分子信息。 这样可以简化整个纯化过程,并提高对每种分离化合物的鉴定的可信度。

在这里,我们描述了在快速色谱和制备型 LC 期间通过质量定向馏分收集从绿茶和姜黄粉中分离天然产物的方法。 出于演示目的,分离出的化合物随后通过大气固体分析探针 (ASAP®) MS 或 HPLC-MS。

姜黄素简介

姜黄素是在姜黄根 (Curcuma longa) 中发现的主要类姜黄素。 它通常用作膳食补充剂和化妆品的成分、烹饪菜肴的调味剂和黄橙色食用色素。 据报道,类姜黄素具有抗氧化和抗炎活性。

用乙醇提取商店购买的姜黄粉 (57.3 g),然后通过滤纸过滤并浓缩。 这产生了 6.4 g 的粗提油,其中含有三种感兴趣的类姜黄素(也比较了图 4 中的 TLC 分析)。


图1:感兴趣的类姜黄素的结构。


图2:商店购买的姜黄粉。


图3:从姜黄粉中提取的粗油。


图4: 在 365 nm 处对姜黄提取物 (97:3 DCM:MeOH) 进行的 TLC 分析以及转移到 puriFlash 的方法的色谱图® 5.250 采用紫外检测。

方法开发

姜黄提取物首先在 TLC 板上进行分析,然后将方法转移到 puriFlash® 5.250 系统使用两个波长的 UV 检测。 在 254 nm 处检测到四种化合物,在 427 nm 处检测到三种假定的姜黄素类化合物,但是,在 UV 检测中对各个化合物没有特异性。

使用等度方法(97:3 二氯甲烷:甲醇)作为 TLC 上显示的最佳分离。 在 12g、15μm 球形硅胶柱 (PF-15SIHC-F0012) 上纯化粗物质。 将 32 mg 的粗重干式加载到 250 mg 的硅胶上,并加载到 4 g 干式加载柱 (PF-DLE-F0004) 中。 使用 XIC 通道收集每种感兴趣化合物的馏分。


图5:使用参数运行的快速色谱方法的屏幕截图。

质谱仪设置通过 InterSoft 控制®puriFlash 上的 X 软件® 系统。 质谱仪装有 APCI 源并以负电离采集模式运行。


图6:用于色谱运行的质谱仪参数的屏幕截图。

实验

质量导向馏分收集

提取离子色谱图 (XIC) 通过绘制所选质荷比值处观察到的信号的强度而创建。 这允许感兴趣化合物的低噪声信号。 此处 XIC 通道设置为检测三种感兴趣的姜黄素。


图7: 姜黄提取物 (97:3 DCM:MeOH) 的 TLC 分析和转移到 puriFlash 的方法的色谱图® 5.250 使用 MS XIC 检测。




图8:puriFlash 提供的每个峰的质谱图® 英特软件®X软件。

尽快® MS 分数确认

使用 ASAP 对纯馏分(1.1、1.2 以及合并的 1.3 和 1.4)进行额外分析® 负极性 MS。 检测到的质量与理论 [MH]-m/z 值一致。




图9:分离化合物的质谱图证实了它们的身份和纯度。

介绍,绿茶儿茶素

基于干重,干绿茶通常含有 10-30% 的多酚,儿茶素是主要的茶多酚,包括:(−)-表没食子儿茶素 (EGC)、(−)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 (EGCG)、(−) -表儿茶素- 3-没食子酸酯 (ECG) 和 (−)-没食子儿茶素没食子酸酯 (GCG)。 EGCG 是含量最丰富且具有生物活性的儿茶素,从生茶提取物中分离纯化儿茶素可大大提高其市场可用性和价值。

将干燥的绿茶叶提取到热水中,然后用乙酸乙酯分配,通过滤纸过滤,蒸发得到粗提取物。 然后将干提取物溶解在 7.5 mL 水中,并在进一步处理前用 0.2 μm 过滤器过滤。


图10:浸泡绿茶叶。


图11: 绿茶中的主要儿茶素。

方法开发
通过 HPLC-UV/MS 分析,可在茶提取物中检测到 EGC、EGCG、GCG、EC 和 ECG(图 12)。

溶剂 A:水
溶剂 B:甲醇
紫外线:275 纳米
MS:150-900 全扫描
立柱:US15C18HP-250/046


图12:绿茶提取物的 HPLC-UV 色谱图、MS 数据和 EGCG 标准用于化合物确认(数据未显示)。

质谱仪设置通过 InterSoft 控制®puriFlash 上的 X 软件® 系统。 质谱仪配有 ESI 源并以负电离采集模式运行。


图13:用于色谱运行的质谱仪参数的屏幕截图。

质量导向馏分收集
此处 XIC 通道设置为检测感兴趣的 4 种儿茶素。 EGCG 和 CGC 是异构体,因此质量相同。


图14: 转移到 puriFlash 的方法的色谱图® 5.250 使用 MS XIC 检测。


图15:InterSoft 提供的每个峰的质谱图®X软件。

结论

• 对于天然产物的分离,最大的挑战之一是在复杂的提取物混合物中鉴定感兴趣的化合物。
• 串联使用质谱和色谱法,我们可以分离和鉴定复杂混合物中的化合物,具有高纯度和准确度,无需进一步鉴定收集的馏分。
• 收集的馏分可以直接通过 InterSoft 提供的 MS 数据进行表征®puriFlash 上的 X 软件® 系统。
• puriFlash® 5.250 及以上expression® CMS 在纯化和鉴定天然产物(例如绿茶中的儿茶素和姜黄中的姜黄素)方面发挥着强大的作用。