使用 puriFlash® 5.250 PrepLC 和 ex 从复杂混合物中纯化生物活性肽expression® CMS 探测器
控制系统
质谱： exexpression® CMS
闪光灯： puriFlash® 5.250 制备液相色谱
HPLC： AVANT®
作者
郝长通
Advion Interchim 科学
介绍
近年来，生物制药公司越来越多地采用基于肽/蛋白质的药物，因为与传统的小分子药物相比，它们具有增强的特异性和选择性。 然而，药物发现过程中肽/蛋白质的纯化对于确保最终产品的安全性和有效性至关重要。 生物活性目标化合物达到尽可能高的纯度对于最大限度地降低毒性风险和遵守监管标准至关重要。[1,2]
乳清分离蛋白是奶酪生产的副产品，含有多种糖巨肽和两种重要的生物活性肽，即分子量 (MW) 为 6757 Da 的酪蛋白巨肽 A (CMPa) 和分子量 (MW) 为 6787 Da 的酪蛋白巨肽 B (CMPb) 。 提取和纯化单个成分，例如酪蛋白
巨肽对于研究其生物活性至关重要。[3]
在本应用说明中，我们以乳清分离蛋白和两种酪蛋白巨肽为例，演示使用 puriFlash 组成的系统分离和纯化生物活性成分® 5.250 prepLC 在线耦合到 exexpression® CMS 检测器。 与 UV 或 ELSD 等传统检测器相比，这种组合提供了更高的选择性和灵敏度，传统检测器可能无法有效地响应生物活性目标肽和蛋白质。
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puriFlash® 5.250
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exexpression® CMS
付款方式
乳清分离蛋白的制备
• 本申请中使用的酪蛋白巨肽分离程序基于 Tadao Saito 的工作[4] 有一些修改。
• 将从当地杂货店购买的 50 g 乳清分离蛋白样品与 500 mL 70% 水和 30% 甲醇 (v/v) 的溶剂混合物混合。 将混合物在70℃下超声处理90分钟，然后减压过滤。
·使用旋转蒸发器在300℃减压下除去甲醇，将所得滤液浓缩至体积40mL。 然后将其在 4°C 下保存一小时。 随后，将等体积的冷乙醇添加到溶液中，并将混合物涡旋5分钟，然后在4°C下再保存4小时。
·使用0.5μm过滤器在减压下过滤混合物。 然后使用旋转蒸发器在减压下将最终滤液浓缩至体积50mL。
• 将 100 µL 等份浓缩提取物与 900 µL 去离子 (DI) 混合
用于分析型 HPLC/MS 分析的水。
• 剩余的滤液用于使用 puriFlash 进行肽纯化® 5.250 PrepLC 系统与 ex 耦合expression® CMS 检测器。
表1： 分析 HPLC/MS 方法设置
分析 HPLC/MS 方法设置
首先使用 AVANT 分析乳清分离蛋白的液体提取物® HPLC/CMS 系统和针对所用 4.6 mm 色谱柱开发的色谱分离方法（表 1）。
图 1a 显示了液体提取物的 HPLC/MS 色谱图。 6.44 分钟处峰的平均 MS 谱表明该化合物是多电荷肽，在 m / z 755.2、849.4、970.6、1132.1 和 1358.6（图 1b）形成电荷分布。
通过软件电荷反卷积，确定肽的不带电荷质量为 6787.4 Da，表明酪蛋白巨肽 B（CMPb，理论质量为 6787 Da）（图 1c）。
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AVANT® （U）HPLC
图1： (a) 乳清蛋白分离物液体提取物的 HPLC/MS 色谱图，(b) 室温 6.44 分钟处峰的平均 MS 谱图，(c) 室温 6.44 分钟处肽洗脱峰的解卷积、不带电质量。
图2： (a) 乳清蛋白分离物液体提取物的 HPLC/MS 色谱图，(b) 室温 11.02 分钟时峰的平均 MS 谱图，(c) 室温 11.02 分钟时洗脱的肽的解卷积、不带电质量。
从 11.02 分钟洗脱峰获得的平均 MS 谱表明，该化合物也是一种多电荷肽，质量为 m/z 751.5、845.4、966.1、1126.8 和 1352.1（图 2b），形成其电荷分布。
同样，电荷解卷积确定该肽的不带电质量为 6755.3 Da，表明酪蛋白巨肽 A 变体 CMPa 的理论质量为 6755 Da（图 2c）。
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puriFlash® 5.250，MS 分离器和前expression® CMS
PrepLC/MS 色谱法
下一步，将分析分离方法转换为更大的制备规模，从 4.6 mm 柱内径改为 30 mm 柱内径，并进一步优化 puriFlash 上两种 CMP（酪蛋白糖巨肽）的纯化® 5.250 PrepLC/Flash 系统与 ex 在线耦合expression® CMS 检测器。
乳清分离蛋白的 PrepLC-UV/MS 色谱图如图 3 所示，参数如表 2 所示。
馏分收集是根据 MS 信号触发的，之所以选择 MS 信号是因为它具有更高的选择性和灵敏度。 970-971 Da 的 XIC 用于检测 CMPb，965-966 Da 的 XIC 用于检测 CMPa。
使用旋转蒸发器在负压下除去级分11-17和级分18-22的组合中的有机溶剂，并且剩余的水性溶液
使用 LABCONCO Freezone 2.5L（-50℃）冻干机干燥溶液，得到每份 10 mg 的干燥收集物，然后将其溶解在 10 ml 去离子水中用于后续 HPLC/UV/MS 分析。 纯度分析结果如图4和图6所示。
表2： PrepLC/MS 方法设置
图3： 两种乳清分离蛋白的 PrepLC-UV/MS 色谱图
成果
CMPb 的纯度分析
合并级分 11 至 17 中 CMPb 的纯度分析如图 4 所示。MS 分析显示检测到四种主要离子，m/z 分别为 970.8、1132.3、1358.6 和 1968.2（图 4b）。
根据图 4b 的平均质谱，确定 5.94 分钟处峰的不带电质量为 6788.4（CMPb，图 4c）。 然而，MS 分析还可以检测 6758.3、6773.5、6804.8 和 6868.4 Da 处的四种微量成分。
获得的 CMPb 的 UV 纯度为 86.7%（图 4d），但是根据额外的 MS 数据，化合物纯度实际上低于该值（估计为 80%）。
根据分析运行的 UV 分析，测得合并级分 18 至 22 中的 CMPa 为 94.7%（图 5a）。
解卷积不带电质量分析显示 CMPa 的预期主要质量为 6756.2（图 5b），以及 6774.6 处的一个次要成分（CMPa 的氧化形式）。
该示例再次显示了 MS 检测肽和蛋白质等生物活性化合物的价值，以及与 UV 相比 MS 检测具有更好的特异性。
图4： (a) 11-17 合并馏分的 HPLC-MS 色谱图，(b) 在 RT 5.94 分钟时洗脱的峰的平均 MS 谱图，(c) (b) 中的不带电质量，(d) 合并馏分的 HPLCUV 色谱图11-17。
图5： (a) 18-22 的合并级分的 HPLC-UV 色谱图。 (b) CMPa 的解卷积不带电质量。
最终的总体纯度估计约为。 90%，对于药物发现中的生物活性分子来说具有极高的价值。
通过选择性馏分可以进一步提高纯度——但代价是产量。 例如，CMPa 级分 20 的 HPLC-UV/MS 分析（图 6a）显示 UV 纯度为 99.0%（图 6d），并且 MS 分析中没有氧化副产物。
图6： (a) 馏分 20 的 HPLC-MS 色谱图，(b) 室温 5.71 分钟时峰的平均 MS 谱图，(c) CMPa 的解卷积不带电质量 (d) 馏分 20 的 HPLCUV 色谱图。
结论
puriFlash® 5.250 PrepLC/Flash 系统，与 ex 在线耦合expression® CMS 检测器具有出色的性能，有助于以高置信度从复杂基质中选择性纯化生物活性大肽。 与 UV 或 ELSD 检测器相比，质谱仪具有卓越的选择性和灵敏度。
该方法的一个说明性应用显示了酪蛋白二醇大肽的分离，通过高产率的组合级分，获得了 80% (CMPb) 至 90% (CMPa) 的纯度范围。 通过选择性馏分，可以实现高达 99.0% 的更高纯度。
参考文献：
[1]格拉斯伦德，S.，等人。 （2008）。 蛋白质生产和纯化。 自然方法，5(2), 135-146。
[2]生物制药加工：制造工艺的开发、设计和实施。
[3]林T.，等人。 (2021) 牛奶中的生物活性物质：化学、技术和应用营养评论 v79(S2):48–69
[4]Saito T.，呃。 (1991)从甜奶酪乳清中分离酪蛋白糖肽的新方法。 J.乳制品科学。 74、2831-2837