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黑米中花青素-3-葡萄糖苷的提取、鉴定、纯化及定量

致力于科学，致力于您

控制系统
闪光灯： puriFlash® 5.250，XS-Vap®
质谱： exexpression® 紧凑型质谱仪（CMS）
HPLC： AVANT™

介绍
大米是世界上最重要的食物之一，尤其是在亚洲国家。 在色素米品种中，黑米因其高营养价值和有益健康特性而受到越来越多的关注。 黑米是富含花青素的色素米，含有花青素-3-葡萄糖苷（Cyn-3-Glu）、花青素-3-芸香苷（Cyn-3-Rut）、芍药苷-3-葡萄糖苷（Pn-3-Glu）等花青素。 Cyanidin-3-glucoside 是黑米中的主要花青素。

本应用简报介绍了如何从黑米中提取花青素-3-葡萄糖苷并使用 prepLC/Flash 系统进行纯化。 Cyn-3-Glu 的含量和纯度使用经过认证的参考标准进行测量。

付款方式
花青素-3-葡萄糖苷提取
黑米从当地杂货店购买，用香料研磨机研磨成细粉，并用以下方法提取：
1. 将 30 克磨碎的黑米与 200 mL 用 1.0 N HCl 酸化的甲醇（85:15，v/v）混合，并超声处理 15 分钟。
2. 将混合物在 7500℃、4 rpm 下离心 5 分钟。 将上清液倒入干净的烧瓶中。 再次用 200 N HCl（1.0:85，v/v）酸化的 15 ml 甲醇提取沉淀，并超声处理 15 分钟。
3.合并两次提取的上清液并使用旋转蒸发器减少至25ml。
4.一小部分浓缩提取物用水稀释10倍用于HPLC/UV/MS分析，其余部分直接加载到PrepLC/Flash系统上进行纯化。

分析 HPLC/UV/MS 设置
表1： 黑米提取物的分析 HPLC/UV/MS 方法。

黑米提取物的分析型 HPLC/MS 分析
将黑米浓缩提取物用蒸馏水稀释 10 倍，用于 HPLC/CMS 分析。

质量范围为 200 至 800 Da，HPLC/MS 色谱图如图 1a 所示。 图 12.10b 显示了 1 分钟处峰的平均 MS 谱图，其中单个离子在 m / z 449.2 在正 ESI 模式下检测到。 具有源内 CID 的 MS 谱图如图 1c 所示，显示了在 m / z 287.0

图1： A）。 黑米提取物的 HPLC/MS 色谱图，B)。 12.10 分钟处峰的平均质谱，C)。 12.10V 源内 CID 下 30 分钟处峰值的平均质谱。

MS 光谱数据库搜索
通过Advion Data Express中的MS谱数据库搜索，确认12.1分钟洗脱的化合物为Cyanidin-3-glucoside (Cyn-3-Glu)。

图2： 图 1c 中提取的平均 MS 谱图的库搜索结果。

Peak Express 软件有助于检测其他花青素
Data Express 中实现的 Peak Express™ 软件可以动态确定所有被检测离子的强度变化率和标准偏差，并且仅显示超过预设阈值设置的离子。

Peak Express™ 有助于检测 ΔIC 色谱图中 14.41 分钟处的另一个峰（图 3b），该峰在 TIC 色谱图中几乎没有显示（图 3a）。 具有源内 CID 的 ΔS Delta 谱显示在 m/z 463.3 和 301.1 处检测到两个离子。

质谱数据库检索确定为Peonidin-3-O-glucoside（检索结果见图4）。

图3： A）。 黑米提取物的 HPLC/MS 色谱图，B)。 黑米提取物C)的ΔIC色谱图。 14.41 分钟峰值的 ΔS Delta 频谱，源内 CID 电压为 30V

图4： 图3c中ΔS Delta谱的库搜索结果

黑米提取物的 HPLC/UV 分析
还通过 HPLC/UV 分析黑米提取物。 在 3 分钟时，在 12.01 nm 和 278 nm 处发现了 Cyn-518-Glu 的两个特征紫外吸收峰（图 5b）。

520 nm 用于触发 PrepLC/Flash 系统纯化中的级分收集。

图5： A）。 黑米提取物的 HPLC/UV 色谱图，B)。 12.07 分钟处峰值的紫外吸光度曲线

cyn-3-glu 纯化的 PrepLC 方法
表2： 用于 Cyn-3-Glu 纯化的 PrepLC 方法

纯化
黑米提取物纯化在 Advion Interchim Scientific puriFlash 上进行® 5.250 PrepLC/Flash 系统。

溶剂和分离方法的详细信息列于方法表中。 黑米提取物（3 ml 样品）的典型 PrepLC/UV 色谱图如图 6 所示。

收集的每个级分均通过 HPLC-UV/MS 进行额外分析，以确认鉴定并提供额外的纯度分析。

图6： 黑米提取物在 puriFlash 上的 prepLC 色谱图 (520 nm)® 5.250 PrepLC/Flash 系统

馏分 2、5 和 8 的 HPLC/UV 分析
所有级分均通过 HPLC/UV/MS 进行分析。 级分 1 的 HPLC/MS 分析显示存在 m/z 611 的杂质，Cyn-3-Glu 的 UV 响应较低。 馏分2-8的纯度超过97.6%。 馏分 2、5 和 8 的 HPLC/UV 色谱图用作图 7 中所示的示例，其中 97.6 的纯度为 2%，馏分 100 和 5 的纯度为 8%。

除第一个级分外，将所有级分合并以干燥。 级分干燥在 Advion Interchim Scientific puriFlash 上进行® 室温下的 XS-Vap 系统。 从3g黑米中纯化得到的Cyn-30-Glu的重量为25.8mg。

图7： 馏分 a) 馏分 2、b) 馏分 5、c) 馏分 8 的 HPLC/UV 色谱图。

通过 HPLC/UV 定量 C3G
为了确认干燥样品的最终纯度，使用经过认证的 Cyn-3-Glu 参考标准品对干燥的 Cyn-3-Glu 进行定量分析，以检查其纯度。 Cyn-3-Glu 参考品的 HPLC 校准曲线如图 8 所示。

测得Cyn-3-Glu的量为25.5mg，纯度为99.0%。

图8： Cyn-3-Glu 参考标准品的 HPLC/UV 校准曲线

结论
利用已开发的 HPLC/UV/MS 和 PrepLC 方法，可以对黑米提取物中的 Cyn-3-Glu 进行分离、纯化和定量。

从25.5g黑米中纯化得到3mg的Cyn-30-Glu，纯度为99.0%。
Interchim PrepLC/Flash 和 Advion HPLC-UV/CMS 的组合是一种简单且经济高效的解决方案，用于从大米样品或含有 Cyn-3-Glu 的样品中提取和纯化 Cyn-3-Glu。

遵循此一般工作流程：

HPLC/CMS 为天然产物纯化中目标化合物的鉴定和纯度分析提供了一种简单的方法。