Extraktion und Reinigung von 3 Curcuminoiden aus Kurkumapulver
Instrumentierung:
Blitz: puriFlash® XS520
Freihandelszone: Plate Express™ DC-Plattenleser
Massenspektrometer: exPresseIon® Kompaktes Massenspektrometer
Probenahme: So schnell wie möglich ® Direkte Analysesonde
Einführung
Curcuminoide sind natürliche Polyphenolverbindungen, die aus der Kurkumawurzel (Curcuma longa) gewonnen werden. Es wird berichtet, dass sie antioxidative Aktivitäten haben1. Curcumin ist das wichtigste Curcuminoid, das in Kurkuma vorkommt. Es wird häufig als Zutat in Nahrungsergänzungsmitteln und Kosmetika, als Aromastoff in kulinarischen Gerichten und als gelb-orange Lebensmittelfarbe verwendet.
In diesem Anwendungshinweis wird eine Methode zur Trennung und Reinigung von 3 Curcuminoiden aus Kurkumapulver mithilfe der Flash-Chromatographie mit dem Advion Interchim Scientific puriFlash beschrieben® XS520 Plus, TLC mit Massenspektrometrie mit dem Plate Express™ TLC Plate Reader und exPresseIon® CMS wird demonstriert. Die Fraktionen wurden mithilfe der Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP) identifiziert®).
Curcuminoid-Extraktion
Das Kurkumapulver wurde abgewogen (57.3 g) und in eine Weithalsglasflasche überführt. Ethanol (250 ml, 200 Proof) wurde in die Flasche gegeben und die Mischung 18 Stunden lang gerührt, während sie mit Folie abgedeckt war. Die interessierenden Verbindungen sind lichtempfindlich. Die Aufschlämmung wurde dann filtriert und das Filtrat zur Trockne konzentriert, um ein bernsteinfarbenes Öl (6.4 g) zu bilden.
Abbildung 1: Strukturen von Curcuminoiden.
Abbildung 2: Im Laden gekauftes Kurkumapulver (links) und Rohextraktöl (rechts).
TLC/MS-Analyse
Der Advion Interchim Scientific Plate Express™ gepaart mit dem ExPresseIon® CMS ermöglicht die einfache Identifizierung von Flecken auf TLC-Platten, ohne dass eine Reinigung oder Probenvorbereitung erforderlich ist (Abbildung 3).
Die erste DC-Analyse zeigte 4 Flecken (Dichlormethan:Methanol, 97:3). Die drei unteren Flecken waren stark fluoreszierend, wie es für die interessierenden Curcuminoide zu erwarten war. TLC-Spots wurden durch APCI-Ionisation im Negativ-Ionen-Modus analysiert. Die unteren drei Flecken wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert.
Abbildung 3: Advion Interchim Scientific exPresseIon® CMS und Plate Express™ TLC Plate Reader (links) und Nahaufnahme des TLC-Plattenextraktionskopfs (rechts).
Abbildung 4: Entwickelte DC-Platte, sichtbar gemacht bei 365 nm. Resultierende Massenspektren von Curcumin (oben), Demethoxycurcumin (Mitte) und Bisdemethoxycurcumin (unten).
Blitzreinigung
Es wurde eine isokratische Methode verwendet, da die im TLC gezeigte Trennung so wie sie ist optimal war. Das Rohmaterial wurde auf einer 25 g, 15 μm großen, sphärischen Kieselgelsäule (PF-15SIHC-F0025) gereinigt. Ein Rohgewicht von 64 mg wurde trocken auf 500 mg Kieselgel geladen und in eine 4-g-Trockenladekartusche (PF-DLE-F0004) geladen.
Abbildung 5: Resultierendes Flash-Chromatogramm der entwickelten TLC-Platte.
Fraktionsidentifizierung durch ASAP®/CMS
Die ExPresseIon® CMS mit dem ASAP® Die Direct Analysis Probe ermöglicht die einfache Identifizierung von Verbindungen, ohne dass LC/MS oder Probenvorbereitung erforderlich sind.
Die reinen Fraktionen (1.1, 1.3 und 1.5) wurden mit dem ASAP analysiert® Sonde mit APCI-Ionisation und positiver Polarität CMS. Die Curcuminoide ionisieren sowohl in positiver als auch in negativer APCI-Polarität gut, jedoch (M+H)+ Ionen zeigten eine geringere Fragmentierung. Die detektierten Massen stimmen mit dem theoretischen [M+H] überein.+ m/z-Werte.
Abbildung 6: Advion Interchim Scientific so schnell wie möglich® Direkte Analysesonde wird direkt in die APCI-fähige Ionenquelle des Ex eingesetztPresseIon® CMS.
Abbildung 7: Massenspektren von Fraktionen.
Die gereinigten Fraktionen wurden zur Trockne konzentriert, um die Feststoffe I (14.1 mg), II (5.6 mg) bzw. III (6.7 mg) zu ergeben, was Curcumin (I), Demethoxycurcumin (II) und Bisdemethoxycurcumin (III) mit 53.4 % darstellt. 21.2 % und 25.3 % des isolierten Curcuminoidprofils. Diese Ergebnisse stimmen mit den angegebenen Literaturwerten überein2.
Bestätigung der Reinheit der Verbindung durch RP-HPLC
Abbildung 8: UV-Scan der gereinigten Fraktionsmischung.
Die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) ermöglicht eine separate Bestätigung der Reinheit der Verbindung nach der Flash-Chromatographie. Eine gleiche Mischung aller drei Verbindungen wurde kombiniert und auf einem Phenomenex Kinetex laufen gelassen® 5 μm Biphenyl 100 Å 50 x 2.1 mm Säule unter Verwendung von isokratischem ACN:Wasser (v:v, 55:45) mit 0.2 % Ameisensäure. Wie erwartet änderte sich die Elutionsreihenfolge der drei Curcuminoide, sodass nun III, II und I eluierten (Abbildung 8). Nach der Entwicklung dieser Methode wurde die jeweilige einzelne gesammelte Fraktion injiziert und auf Reinheit analysiert und erneut durch MS-Analyse bestätigt.
Abbildung 9: UV-Scan und Massenspektrum der Curcumin-Fraktion 1.1.
Abbildung 10: UV-Scan und Massenspektrum der Curcumin-Fraktion 1.3.
Abbildung 11: UV-Scan und Massenspektrum der Curcumin-Fraktion 1.5.
Fazit
Mit einer Kombination aus TLC-Chromatographie, Flash-Chromatographie und Massenspektrometrieunterstützung in verschiedenen Phasen des Prozesses (DC-Plattenidentifizierung, Fraktionsbestätigung und sekundäre Reinheitsanalyse) können wir Curcuminoide aus Kurkumapulver mit bestätigten Reinheitsgraden von >95 % reinigen.
Referenzen: (Die Referenzliste bleibt in der wissenschaftlichen Zitierweise erhalten)
1Jayaprakasha et al. Antioxidative Aktivitäten von Curcumin, Demethoxycurcumin und Bisdemethoxycurcumin. Lebensmittelchemie, Band 98, Ausgabe 4, 2006, Seiten 720–724. ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2Praveen et al. Einfacher NMR-Ansatz zur Profilierung der in Kurkuma vorhandenen Curcuminoide, Lebensmittelchemie, Band 341, Teil 2, 2021, 128646, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.128646.