La extracción, identificación, purificación y cuantificación de cianidina-3-glucósido en arroz negro

Instrumentación
Destello: puriFlash^® 5.250, XS-Vap^®
Espec. de masa: exprensaion^® Espectrómetro de masas compacto (CMS)
HPLC: AVANT™

Introducción
El arroz es uno de los alimentos más esenciales del mundo, especialmente en los países asiáticos. Entre las variedades de arroz pigmentado, el arroz negro ha recibido una atención creciente debido a su alto valor nutritivo y propiedades beneficiosas para la salud. El arroz negro es un arroz pigmentado enriquecido con antocianinas que contiene cianidina-3-glucósido (Cyn-3-Glu), cianidina-3-rutinosido (Cyn-3-Rut), peonidina-3-glucósido (Pn-3-Glu) y otros antocianinas. La cianidina-3-glucósido es la antocianina dominante en el arroz negro.

Esta nota de aplicación muestra cómo se extrae la cianidina-3-glucósido del arroz negro y cómo se purifica con un sistema prepLC/Flash. La cantidad y pureza de Cyn-3-Glu se mide utilizando un estándar de referencia certificado.

Método
Extracción de cianidina-3-glucósido
El arroz negro se compró en una tienda de abarrotes local, se molió en un polvo fino con un molinillo de especias y se extrajo con el siguiente método:
1. Se mezclaron 30 gramos del arroz negro molido con 200 ml de metanol acidificado con HCl 1.0 N (85:15, v/v) y se sonicó durante 15 min.
2. La mezcla se centrifugó a 7500 rpm a 4°C durante 5 min. El sobrenadante se decantó en un matraz limpio. El sedimento se extrajo de nuevo con 200 ml de metanol acidificado con HCl 1.0 N (85:15, v/v) y se sonicó durante 15 min.
3. El sobrenadante de las dos extracciones se combinó y se redujo a 25 ml utilizando un evaporador rotatorio.
4. Una pequeña parte del extracto concentrado se diluyó 10 veces con agua para análisis HPLC/UV/MS, el resto se cargó directamente en un sistema PrepLC/Flash para purificación.

Configuración analítica de HPLC/UV/MS
Tabla 1: Método analítico HPLC/UV/MS para el extracto de arroz negro.

Análisis HPLC/MS analítico de extracto de arroz negro
El extracto concentrado de arroz negro se diluyó 10x con agua destilada para análisis HPLC/CMS.

Con un rango de masas de 200 a 800 Da, el cromatograma HPLC/MS se muestra en la Figura 1a. El espectro MS promedio desde el pico a los 12.10 min se muestra en la Figura 1b con un solo ion en m / z 449.2 detectado en el modo ESI positivo. El espectro de MS con CID en la fuente se muestra en la Figura 1c que muestra un ion de fragmento confirmatorio en m / z 287.0

Figura 1: A). El cromatograma HPLC/MS del extracto de arroz negro, B). Los espectros de masa promedio del pico a los 12.10 min, C). Los espectros de masa promedio del pico a los 12.10 min con CID en la fuente a 30 V.

Búsqueda en la base de datos de espectros de MS
Mediante la búsqueda en la base de datos de espectros de MS en Advion Data Express, el compuesto eluido a los 12.1 min se confirma como cianidina-3-glucósido (Cyn-3-Glu).

Figura 2: Resultado de la búsqueda en la biblioteca de los espectros de MS promedio en el extracto de la Figura 1c.

El software Peak Express ayuda a detectar otras antocianinas
El software Peak Express™ implementado en Data Express puede determinar dinámicamente la tasa de cambio de intensidad y la desviación estándar de todos los iones que se detectan y solo muestra los iones que superan un umbral predeterminado.

Peak Express™ ayuda a detectar otro pico a los 14.41 min en el cromatograma ΔIC (Figura 3b) que apenas se indica en su cromatograma TIC (Figura 3a). ΔS Delta Spectrum con el CID en la fuente muestra dos iones detectados en m/z 463.3 y 301.1.

La búsqueda en la base de datos de espectro de MS determina que se trata de peonidina-3-O-glucósido (el resultado de la búsqueda se muestra en la Figura 4).

Figura 3: A). El cromatograma HPLC/MS del extracto de arroz negro, B). El cromatograma ΔIC del extracto de arroz negro C). El espectro Delta ΔS del pico a los 14.41 min con CID en la fuente a 30 V

Figura 4: El resultado de la búsqueda en la biblioteca de ΔS Delta Spectrum en la Figura 3c

Análisis HPLC/UV del extracto de arroz negro
El extracto de arroz negro también se analizó por HPLC/UV. Se encuentran dos picos de absorción UV característicos de Cyn-3-Glu a los 12.01 min a 278 nm y 518 nm (Figura 5b).

Se utiliza 520 nm para activar la recogida de fracciones en la purificación con un sistema PrepLC/Flash.

Figura 5: A). El cromatograma HPLC/UV del extracto de arroz negro, B). El perfil de absorbancia UV desde el pico a los 12.07 min

Método PrepLC para la purificación de cyn-3-glu
Tabla 2: Método PrepLC para la purificación de Cyn-3-Glu

Purificación
Las purificaciones de extracto de arroz negro se realizan en un Advion Interchim Scientific puriFlash^® 5.250 Sistema PrepLC/Flash.

La información detallada de los solventes y el método de separación se encuentra en la tabla de métodos. El cromatograma PrepLC/UV típico del extracto de arroz negro (muestra de 3 ml) se muestra en la Figura 6.

Cada fracción recolectada se analiza adicionalmente por HPLC-UV/MS para confirmar la identificación y proporcionar un análisis de pureza adicional.

Figura 6: El cromatograma prepLC (520 nm) del extracto de arroz negro en puriFlash^® Sistema 5.250 PrepLC/Flash

Análisis HPLC/UV de las fracciones 2, 5 y 8
Todas las fracciones se analizan por HPLC/UV/MS. El análisis HPLC/MS de la fracción 1 muestra una impureza con m/z 611 y una respuesta UV baja de Cyn-3-Glu. Y las fracciones 2-8 tienen una pureza superior al 97.6 %. Los cromatogramas de HPLC/UV de las fracciones 2, 5 y 8 se utilizan como ejemplos que se muestran en la Figura 7 con purezas del 97.6 % para la fracción 2, 100 % para las fracciones 5 y 8.

Excepto por la primera fracción, todas las fracciones se combinaron para la sequedad. El secado de las fracciones se realizó en un Advion Interchim Scientific puriFlash^® Sistema XS-Vap a temperatura ambiente. El peso de Cyn-3-Glu purificado a partir de 30 g de arroz negro es de 25.8 mg.

Figura 7: El cromatograma HPLC/UV de las fracciones a) Fracción 2, b) Fracción 5, c) Fracción 8.

Cuantificación de C3G por HPLC/UV
Para confirmar la pureza final de la muestra seca, se utilizó un patrón de referencia certificado de Cyn-3-Glu para el análisis cuantitativo de Cyn-3-Glu seco para comprobar su pureza. La curva de calibración de HPLC de la referencia Cyn-3-Glu se muestra en la Figura 8.

La cantidad medida de Cyn-3-Glu es de 25.5 mg con una pureza del 99.0 %.

Figura 8: Curva de calibración HPLC/UV del estándar de referencia Cyn-3-Glu

Conclusión
Con los métodos HPLC/UV/MS y PrepLC desarrollados, Cyn-3-Glu en el extracto de arroz negro se puede separar, purificar y cuantificar.

Se purificaron 25.5 mg de Cyn-3-Glu a partir de 30 g de arroz negro con una pureza del 99.0 %.
La combinación de Interchim PrepLC/Flash y Advion HPLC-UV/CMS es una solución simple y rentable para extraer y purificar Cyn-3-Glu de muestras de arroz o muestras que contienen Cyn-3-Glu.

Siguiendo este flujo de trabajo general:

HPLC/CMS proporciona una forma sencilla para la identificación y el análisis de pureza de los compuestos objetivo en la purificación de productos naturales.