ウコン粉末からの 3 つのクルクミノイドの抽出と精製

計装：
フラッシュ： puriFlash^® XS520
TLC： Plate Express^™ TLCプレートリーダー
マススペック: ex expression CMS^® コンパクト質量分析計
サンプリング： ASAP®^® 直接分析プローブ

概要

クルクミノイドは、ウコンの根 (Curcuma longa) に由来する天然のポリフェノール化合物です。 抗酸化作用があると報告されています¹. クルクミンはウコンに含まれる主要なクルクミノイドです。 栄養補助食品や化粧品の成分、料理の香料、黄橙色の食品着色料として一般的に使用されています。

このアプリケーション ノートでは、Advion Interchim Scientific puriFlash を使用したフラッシュ クロマトグラフィーを使用して、ウコン粉末から 3 つのクルクミノイドを分離および精製する方法について説明します。^® XS520 Plus、Plate Express™ TLC プレートリーダーおよび ex を使用した質量分析を備えた TLC expression CMS^® CMS が表示されます。 分数は、大気固体分析プローブ (ASAP) を使用して特定されました。^®).

クルクミノイド抽出

ウコン粉末を秤量し（５７．３ｇ）、広口ガラス瓶に移した。 エタノール（２５０ｍＬ、２００プルーフ）をボトルに加え、ホイルで覆いながら混合物を１８時間撹拌した。 目的の化合物は光に敏感です。 次に、スラリーを濾過し、濾液を濃縮乾固して、琥珀色の油（６．４ｇ）を形成した。

図1： クルクミノイドの構造。

図2： 市販のウコン粉末（左）と粗抽出油（右）。

TLC/MS分析

exとペアになったAdvion Interchim Scientific Plate Express™ expression CMS^® CMS により、精製やサンプル調製を必要とせずに、TLC プレート上のスポットを簡単に識別することができます (図 3)。

最初の TLC 分析では、4 つのスポットが示されました (ジクロロメタン:メタノール、97:3)。 対象のクルクミノイドで予想されるように、下の 3 つのスポットは強い蛍光性を示しました。 TLC スポットは、負イオン モードで APCI イオン化によって分析されました。 下の XNUMX つのスポットは、質量分析によって特徴付けられました。

図3： Advion Interchim Scientific ex expression CMS^® CMS と Plate Express™ TLC プレート リーダー (左) と TLC プレート抽出ヘッドの拡大図 (右)。

図4： 365 nm で視覚化された開発済み TLC プレート。 クルクミン (上)、デメトキシクルクミン (中)、およびビスデメトキシクルクミン (下) の質量スペクトルの結果。

フラッシュ浄化

TLC で示された分離がそのまま最適であったため、アイソクラティック メソッドを使用しました。 粗物質を２５ｇ、１５μｍの球状シリカゲルカラム（ＰＦ－１５ＳＩＨＣ－Ｆ００２５）で精製した。 25 mg の粗重量を 15 mg のシリカゲルに乾式装填し、15 g 乾式装填カートリッジ (PF-DLE-F0025) に装填しました。

図5： 開発された TLC プレートから得られたフラッシュ クロマトグラム。

ASAPによるフラクション同定^®/ CMS

ex expression CMS^® ASAP を使用した CMS^® Direct Analysis Probe により、LC/MS やサンプルの調整を必要とせずに、化合物を簡単に同定できます。

純粋な画分 (1.1、1.3、および 1.5) は、ASAP を使用して分析しました。^® APCI イオン化および正極性 CMS を備えたプローブ。 ただし、クルクミノイドは APCI の正極性と負極性の両方でよくイオン化しますが、(M+H)⁺ イオンはフラグメンテーションが少ないことを示しました。 検出された質量は、理論上の [M+H] と一致しています。⁺ m/z 値。

図6： Advion Interchim Scientific 至急^® 直接分析プローブは、ex の APCI 対応イオン源に直接挿入されます。 expression CMS^® CMS。

図7： 分数の質量スペクトル。

精製された画分を濃縮乾固して、それぞれ固体Ｉ（１４．１ｍｇ）、ＩＩ（５．６ｍｇ）およびＩＩＩ（６．７ｍｇ）を得た。これは、５３．４％でクルクミン（Ｉ）、デメトキシクルクミン（ＩＩ）、およびビスデメトキシクルクミン（ＩＩＩ）を表す。 14.1%、および分離されたクルクミノイド プロファイルの 5.6%。 これらの結果は、報告された文献値と一致しています².

RP-HPLCによる化合物の純度の確認

図8： 精製されたフラクション混合物の UV スキャン。

逆相高速液体クロマトグラフィー (RP-HPLC) では、フラッシュ クロマトグラフィー後に化合物の純度を個別に確認できます。 XNUMX つの化合物すべての等量混合物を組み合わせ、Phenomenex Kinetex で実行しました。^® 5 μm Biphenyl 100 Å 50 x 2.1 mm カラムで、アイソクラティック ACN:水 (v:v、55:45) と 0.2% ギ酸を使用。 予想どおり、8 つのクルクミノイドの溶出順序が変わり、現在は III、II、および I が溶出しています (図 XNUMX)。 このメソッドを開発した後、それぞれの単一の収集された画分が注入され、純度が分析され、MS 分析によって再度確認されました。

図9： クルクミン画分 1.1 の UV スキャンと質量スペクトル。

図10： クルクミン画分 1.3 の UV スキャンと質量スペクトル。

図11： クルクミン画分 1.5 の UV スキャンと質量スペクトル。

まとめ

プロセスのさまざまな段階 (TLC プレート識別、フラクション確認、二次純度分析) での TLC クロマトグラフィー、フラッシュ クロマトグラフィー、および質量分析サポートの組み合わせにより、95% を超える確認された純度レベルでウコン粉末からクルクミノイドを精製できます。

参照：
¹ジャヤプラカシャ等。 クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミンの抗酸化作用。 食品化学、第 98 巻、第 4 号、2006 年、720 ～ 724 ページ。 ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
²プラビーン等。 ウコンに存在するクルクミノイドをプロファイリングするための容易な NMR アプローチ、Food Chemistry、第 341 巻、第 2 部、2021 年、128646、https://doi.org/10.1016/j。 foodchem.2020.128646.