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Análisis cualitativo de oligonucleótidos utilizando Advion Interchim Scientific® Sistema HPLC-UV/MS

Instrumentación
Espec. de masas: exprensaion® Espectrómetro de masas compacto (CMS)
HPLC: AVANTE®

Introducción

Los oligonucleótidos han ganado una atención significativa en el desarrollo biofarmacéutico debido a su
Capacidad para modular la expresión de genes o proteínas. Su éxito clínico es evidente con la aprobación de varios fármacos basados ​​en oligonucleótidos o su avance en ensayos clínicos.[ 1 ] Estos medicamentos incluyen oligonucleótidos antisentido, terapias de ARN pequeño de interferencia (ARNip) y vacunas basadas en ARNm, ejemplificadas por el desarrollo exitoso de las vacunas COVID-19. Estos logros han estimulado un mayor interés e inversión en la investigación y el desarrollo de oligonucleótidos.

La síntesis en fase sólida es un método comúnmente utilizado para producir secuencias de oligonucleótidos. La materia prima normalmente se purifica mediante diversas técnicas, como desalinización, ultrafiltración, extracción en fase sólida (SPE), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía líquida preparativa (prepLC), según el nivel de pureza deseado. A menudo se prefieren los métodos HPLC de emparejamiento iónico o prepLC, ya que ofrecen una mayor pureza en comparación con otras técnicas.

Esta nota de aplicación tiene como objetivo demostrar el análisis HPLC/UV de múltiples muestras de oligo y utilizar el análisis HPLC/CMS para determinar su peso molecular.

Método

Sistema HPLC-UV/CMS
Con una bomba cuaternaria y una válvula de selección de columna, el proceso de cambiar entre diferentes tampones y columnas para diversos análisis se vuelve notablemente sencillo, eliminando la necesidad de realizar manualmente
retirar la columna y cambiar el disolvente. Esta automatización mejora enormemente la eficiencia y la conveniencia en el proceso analítico.

Tabla 1: Lista de instrumentos de elementos


Imprimación oligo(dT) 12-18
Se utilizó el cebador Oligo(dT) 12-18 (Thermos Fisher Scientific, MA) para comprobar el método de HPLC para el análisis de oligonucleótidos.

La separación de estos cebadores Oligo(dT) 12-18 se llevó a cabo utilizando un método de HPLC de fase inversa de pares iónicos con una columna Interchim Uptisphere Strategy de 5 µm C18HQ de 250 x 4.6 mm. Se inyectó una alícuota de 10 µl para todos los análisis y la temperatura de la columna se mantuvo a 30°C. La composición de la fase móvil A era TEAA 100 mM en agua, mientras que la fase móvil B es acetonitrilo. Y el caudal es de 1 ml/min.

El análisis por HPLC se desarrolló de la siguiente manera: después de la inyección de la muestra, la fase móvil B se ajustó al 10 % durante 1 minuto. Luego se aumentó linealmente al 15 % durante 24 minutos. A los 25.1 minutos, aumentó hasta el 95% y se mantuvo en este nivel durante 2.4 minutos para limpiar la columna. Posteriormente, a los 27.6 minutos, se redujo al 10% y se mantuvo durante 2.4 minutos para equilibrar la columna.

La Figura 1 ilustra que el método HPLC separa eficazmente los siete cebadores Oligo(dT) 12 a 18.

Figura 1: Análisis HPLC/UV de Oligo(dT)12-18


Estándar de ARN con 4 componentes
La mezcla de oligonucleótidos de ARN (Aglient Technologies, CA) se preparó diluyéndola 10 veces con agua desionizada antes del análisis por HPLC. Las secuencias de cuatro estándares de ARN son las siguientes: 14 mer (CACUGAAUACCAAU), 17 mer (UCACACUGAAUACCAAU), 20 mer (UCAUCACACUGAAUACCAAU) y 21 mer (GUCUCAUCACACUGAAUACCAAU).

La separación de estas muestras de ARN se realizó utilizando un método de HPLC similar al de los cebadores oligo(dT)12-18, con ligeras modificaciones.

El análisis por HPLC se desarrolló de la siguiente manera: después de la inyección de la muestra, la fase móvil B se ajustó al 9 % durante 1 minuto. Luego se aumentó linealmente al 10 % durante 24 minutos. A los 25.1 minutos, aumentó hasta el 95% y se mantuvo en este nivel durante 2.4 minutos para limpiar la columna. Posteriormente, a los 27.6 minutos, se redujo al 9% y se mantuvo durante 2.4 minutos para equilibrar la columna.

La Figura 2 ilustra que el método HPLC separa eficazmente las cuatro muestras de ARN, incluso con una diferencia de 1 mer entre las muestras de ARN de 20 y 21 mer. Esta separación de referencia para los 20 meros y 21 meros es crucial para analizar oligonucleótidos sintéticos, ya que la mayoría de las impurezas durante la síntesis suelen ser N=1 mer o N+1 mer.[ 2 ]


Muestras de ADNss
También se analizaron tres muestras de ADN monocatenario (ssDNA) con 17 mer (GTCAGCAAGGACATCGT), 18 mer (CATTTGAGTAGCCAACGC) y 19 mer (GGACACTTTCATGCGAGTT) utilizando el método de HPLC modificado del utilizado para las muestras de ARN.

La concentración de cada ssDNA fue de 30 μM y se cargaron alícuotas de 10 μL en la columna para su análisis. El análisis de HPLC se realizó utilizando el siguiente gradiente: después de la inyección de la muestra, la fase móvil B (MPB) se ajustó al 9 % durante 1 minuto y luego se aumentó linealmente al 15 % durante 24 minutos. A los 25.1 minutos, aumentó hasta el 95% y se mantuvo en este nivel durante 2.4 minutos para limpiar la columna. A los 27.6 minutos, el MPB se redujo al 9% y este nivel se mantuvo durante 2.4 minutos para equilibrar la columna. El caudal para el análisis se ajustó a 1.5 ml/min. A pesar del mayor cambio en el disolvente B por minuto en comparación con las muestras de ARN, la Figura 3 demuestra que el método separa eficazmente las tres muestras de ssDNA con una buena resolución inicial.

Figura 3: Análisis HPLC/UV de tres muestras de ADNss 1-3, tres muestras de ADN monocatenario con ADNss-1: 17 mer (GTC AGC AAG GAC ATC GT); ssDNA-2: 18 mer (CAT TTG AGT AGC CAA CGC) y ssDNA-3: 19 mer (GGA CAC TTT CAT GCG AGT T).


Análisis de pureza de una muestra de ssDNA
Con el mismo método utilizado para las muestras de ssDNA que se muestra en la figura 3, también se empleó para el análisis de pureza de una muestra de ssDNA: 19 mer (5'-TGGCGGGCGTACCTGGACT-3').

La Figura 4 revela que el ssDNA 19 de 4 unidades tiene una pureza UV del 74.3 % a 260 nm que se determinó utilizando el software Advion Data Express.


Análisis de MS de la muestra de ssDNA utilizada en el análisis de pureza F.5
El análisis HPLC/MS de oligonucleótidos se realizó utilizando un Advion AVANT® Sistema HPLC acoplado con un Advion Exprensaion® CMS-L. Para el análisis de MS se utilizó la columna Interchim Uptisphere Strategy 2.6 μm C18-HQ con dimensiones 50 x 2.1 mm, con un caudal de 0.2 ml/min. La temperatura de la columna se ajustó a 55°C.

En comparación con el uso de TEAA para el análisis de masas de oligonucleótidos, los reactivos de pares iónicos que combinan TEA y HFIP ofrecen un rendimiento significativamente mejorado. Por lo tanto, esta nota de aplicación se centrará en el empleo de reactivos de pares iónicos TEA y HFIP para el análisis de oligonucleótidos por HPLC/MS.

La fase móvil consistió en TEA 15 mM y HFIP 10 mM en agua como fase móvil A y metanol como fase móvil B. El tiempo total de ejecución de HPLC fue de 25 minutos, comenzando con 5% de disolvente B durante 1 minuto.
Luego se aumentó el porcentaje de B al 6 % durante 14 minutos, seguido de un aumento al 95 % a los 15.1 minutos que se mantuvo durante 2.9 minutos para eluir los compuestos de interés. Posteriormente, el % B se redujo al 5 % y se mantuvo en este nivel durante 6.9 ​​minutos para equilibrar la columna antes del siguiente análisis.

El análisis de MS se realizó en modo ESI negativo con el rango de exploración de MS establecido entre 500 y 2000 Da. La Figura 5b muestra los espectros de MS de ssDNA-4, mostrando una envoltura cargada con picos en m/z 1463.9 (4-), 1170.8 (5-), (975.8 (6-), 936.0 (7-), 731.8 (8- ) y 650.2 (9-). Mediante la deconvolución de carga en Data Express, se determinó que la masa sin carga para la muestra de ssDNA era 5861.8 Da, que coincide estrechamente con el valor teórico de 5860.8 Da.

Figura 5: Análisis por HPLC/MS de ssDNA-4 (5-TGG CGG GCG TAC CTG GAC T-3), PM 5860.8 Da


Figura 6: Análisis por HPLC/MS de ssDNA-5 (5-GGGTGG-CAT-TAT-GCT-GAG-T-3), mw 5914.9


Análisis MS de una muestra de ejemplo adicional
Los espectros de MS de ssDNA-5 (5'-GGG-TGG-CAT-TATGCT-GAG-T-3') se representan en la Figura 6, que muestra una envoltura cargada con picos en m/z 1477.8(4-), 1182.1( 5-), 984.7(6-), 843.8(7-) y 738.2(8-). Mediante deconvolución de carga, se determinó que la masa sin carga del ssDNA-5 era 5913.9, lo que concuerda estrechamente con el valor teórico de 5914.9.

Conclusión

Se ha demostrado que el uso de una columna C5HQ con un tamaño de partícula de 18 μm acoplada con un reactivo de emparejamiento iónico TEAA (acetato de trietilamonio) es una solución adecuada para el análisis por HPLC de oligonucleótidos.

Para el análisis MS de oligonucleótidos, se puede emplear la misma columna C18HQ con HFIP (hexafluoroisopropanol) y TEA (trietilamina) como reactivo de apareamiento iónico junto con un AVANT.® Sistema HPLC-UV/CMS. Se ha demostrado que este método produce mediciones de masa precisas adicionales de oligonucleótidos.

En general, utilizar la columna Interchim C18HQ y el reactivo de emparejamiento iónico adecuado en combinación con AVANT® Los sistemas HPLC-UV y -CMS pueden proporcionar una solución confiable para el análisis de pureza y la caracterización de oligonucleótidos.

Referencias
[ 1 ]Roberts, TC, Langer, R. y Wood, MJA Avances en la administración de fármacos con oligonucleótidos. Nat Rev Drug Discov 2020, 19, 673–694
[ 2 ]Martina C. et al. Oligonucleótidos: tendencias actuales y aplicaciones innovadoras en síntesis, caracterización y purificación, Biotecnología J. 2020, 1900226

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La extracción, identificación, purificación y cuantificación de cianidina-3-glucósido en arroz negro

Instrumentación
Destello: puriFlash® 5.250, XS-Vap®
Espec. de masa: exprensaion® Espectrómetro de masas compacto (CMS)
HPLC: AVANT™

Introducción
El arroz es uno de los alimentos más esenciales del mundo, especialmente en los países asiáticos. Entre las variedades de arroz pigmentado, el arroz negro ha recibido una atención creciente debido a su alto valor nutritivo y propiedades beneficiosas para la salud. El arroz negro es un arroz pigmentado enriquecido con antocianinas que contiene cianidina-3-glucósido (Cyn-3-Glu), cianidina-3-rutinosido (Cyn-3-Rut), peonidina-3-glucósido (Pn-3-Glu) y otros antocianinas. La cianidina-3-glucósido es la antocianina dominante en el arroz negro.

Esta nota de aplicación muestra cómo se extrae la cianidina-3-glucósido del arroz negro y cómo se purifica con un sistema prepLC/Flash. La cantidad y pureza de Cyn-3-Glu se mide utilizando un estándar de referencia certificado.

Método
Extracción de cianidina-3-glucósido
El arroz negro se compró en una tienda de abarrotes local, se molió en un polvo fino con un molinillo de especias y se extrajo con el siguiente método:
1. Se mezclaron 30 gramos del arroz negro molido con 200 ml de metanol acidificado con HCl 1.0 N (85:15, v/v) y se sonicó durante 15 min.
2. La mezcla se centrifugó a 7500 rpm a 4°C durante 5 min. El sobrenadante se decantó en un matraz limpio. El sedimento se extrajo de nuevo con 200 ml de metanol acidificado con HCl 1.0 N (85:15, v/v) y se sonicó durante 15 min.
3. El sobrenadante de las dos extracciones se combinó y se redujo a 25 ml utilizando un evaporador rotatorio.
4. Una pequeña parte del extracto concentrado se diluyó 10 veces con agua para análisis HPLC/UV/MS, el resto se cargó directamente en un sistema PrepLC/Flash para purificación.

Configuración analítica de HPLC/UV/MS
Tabla 1: Método analítico HPLC/UV/MS para el extracto de arroz negro.

Análisis HPLC/MS analítico de extracto de arroz negro
El extracto concentrado de arroz negro se diluyó 10x con agua destilada para análisis HPLC/CMS.

Con un rango de masas de 200 a 800 Da, el cromatograma HPLC/MS se muestra en la Figura 1a. El espectro MS promedio desde el pico a los 12.10 min se muestra en la Figura 1b con un solo ion en m / z 449.2 detectado en el modo ESI positivo. El espectro de MS con CID en la fuente se muestra en la Figura 1c que muestra un ion de fragmento confirmatorio en m / z 287.0

Figura 1: A). El cromatograma HPLC/MS del extracto de arroz negro, B). Los espectros de masa promedio del pico a los 12.10 min, C). Los espectros de masa promedio del pico a los 12.10 min con CID en la fuente a 30 V.

Búsqueda en la base de datos de espectros de MS
Mediante la búsqueda en la base de datos de espectros de MS en Advion Data Express, el compuesto eluido a los 12.1 min se confirma como cianidina-3-glucósido (Cyn-3-Glu).

Figura 2: Resultado de la búsqueda en la biblioteca de los espectros de MS promedio en el extracto de la Figura 1c.

El software Peak Express ayuda a detectar otras antocianinas
El software Peak Express™ implementado en Data Express puede determinar dinámicamente la tasa de cambio de intensidad y la desviación estándar de todos los iones que se detectan y solo muestra los iones que superan un umbral predeterminado.

Peak Express™ ayuda a detectar otro pico a los 14.41 min en el cromatograma ΔIC (Figura 3b) que apenas se indica en su cromatograma TIC (Figura 3a). ΔS Delta Spectrum con el CID en la fuente muestra dos iones detectados en m/z 463.3 y 301.1.

La búsqueda en la base de datos de espectro de MS determina que se trata de peonidina-3-O-glucósido (el resultado de la búsqueda se muestra en la Figura 4).

Figura 3: A). El cromatograma HPLC/MS del extracto de arroz negro, B). El cromatograma ΔIC del extracto de arroz negro C). El espectro Delta ΔS del pico a los 14.41 min con CID en la fuente a 30 V

Figura 4: El resultado de la búsqueda en la biblioteca de ΔS Delta Spectrum en la Figura 3c

Análisis HPLC/UV del extracto de arroz negro
El extracto de arroz negro también se analizó por HPLC/UV. Se encuentran dos picos de absorción UV característicos de Cyn-3-Glu a los 12.01 min a 278 nm y 518 nm (Figura 5b).

Se utiliza 520 nm para activar la recogida de fracciones en la purificación con un sistema PrepLC/Flash.

Figura 5: A). El cromatograma HPLC/UV del extracto de arroz negro, B). El perfil de absorbancia UV desde el pico a los 12.07 min

Método PrepLC para la purificación de cyn-3-glu
Tabla 2: Método PrepLC para la purificación de Cyn-3-Glu

Purificación
Las purificaciones de extracto de arroz negro se realizan en un Advion Interchim Scientific puriFlash® 5.250 Sistema PrepLC/Flash.

La información detallada de los solventes y el método de separación se encuentra en la tabla de métodos. El cromatograma PrepLC/UV típico del extracto de arroz negro (muestra de 3 ml) se muestra en la Figura 6.

Cada fracción recolectada se analiza adicionalmente por HPLC-UV/MS para confirmar la identificación y proporcionar un análisis de pureza adicional.

Figura 6: El cromatograma prepLC (520 nm) del extracto de arroz negro en puriFlash® Sistema 5.250 PrepLC/Flash

Análisis HPLC/UV de las fracciones 2, 5 y 8
Todas las fracciones se analizan por HPLC/UV/MS. El análisis HPLC/MS de la fracción 1 muestra una impureza con m/z 611 y una respuesta UV baja de Cyn-3-Glu. Y las fracciones 2-8 tienen una pureza superior al 97.6 %. Los cromatogramas de HPLC/UV de las fracciones 2, 5 y 8 se utilizan como ejemplos que se muestran en la Figura 7 con purezas del 97.6 % para la fracción 2, 100 % para las fracciones 5 y 8.

Excepto por la primera fracción, todas las fracciones se combinaron para la sequedad. El secado de las fracciones se realizó en un Advion Interchim Scientific puriFlash® Sistema XS-Vap a temperatura ambiente. El peso de Cyn-3-Glu purificado a partir de 30 g de arroz negro es de 25.8 mg.

Figura 7: El cromatograma HPLC/UV de las fracciones a) Fracción 2, b) Fracción 5, c) Fracción 8.

Cuantificación de C3G por HPLC/UV
Para confirmar la pureza final de la muestra seca, se utilizó un patrón de referencia certificado de Cyn-3-Glu para el análisis cuantitativo de Cyn-3-Glu seco para comprobar su pureza. La curva de calibración de HPLC de la referencia Cyn-3-Glu se muestra en la Figura 8.

La cantidad medida de Cyn-3-Glu es de 25.5 mg con una pureza del 99.0 %.

Figura 8: Curva de calibración HPLC/UV del estándar de referencia Cyn-3-Glu

Conclusión
Con los métodos HPLC/UV/MS y PrepLC desarrollados, Cyn-3-Glu en el extracto de arroz negro se puede separar, purificar y cuantificar.

Se purificaron 25.5 mg de Cyn-3-Glu a partir de 30 g de arroz negro con una pureza del 99.0 %.
La combinación de Interchim PrepLC/Flash y Advion HPLC-UV/CMS es una solución simple y rentable para extraer y purificar Cyn-3-Glu de muestras de arroz o muestras que contienen Cyn-3-Glu.

Siguiendo este flujo de trabajo general:

HPLC/CMS proporciona una forma sencilla para la identificación y el análisis de pureza de los compuestos objetivo en la purificación de productos naturales.

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Purificación de péptidos bioactivos a partir de mezclas complejas con puriFlash® 5.250 PrepLC y exprensaion® Detector CMS

Instrumentación
Espec. de masa: exprensaion® CMS
Destello: puriFlash® 5.250 preparación LC
HPLC: AVANT®

Autor
Changtong Hao
Advion Interchim Científico

Introducción
En los últimos años, las empresas biofarmacéuticas han adoptado cada vez más los fármacos basados ​​en péptidos/proteínas debido a su mayor especificidad y selectividad en comparación con los fármacos tradicionales de moléculas pequeñas. Sin embargo, la purificación de péptidos/proteínas durante el proceso de descubrimiento de fármacos es crucial para garantizar la seguridad y eficacia del producto final. Alcanzar los niveles de pureza más altos posibles para los compuestos objetivo bioactivos es esencial para minimizar el riesgo de toxicidad y cumplir con los estándares regulatorios.[ 1,2 ]

El aislado de proteína de suero, un subproducto de la producción de queso, contiene varios glucomacropéptidos y dos péptidos bioactivos significativos, el macropéptido A de caseína (CMPa) con un peso molecular (MW) de 6757 Da y el macropéptido B de caseína (CMPb) con un PM de 6787 Da . Extracción y purificación de componentes individuales, como la caseína.
macropéptido, es esencial para investigar su bioactividad.[ 3 ]

En esta nota de aplicación, usamos aislado de proteína de suero de leche y dos macropéptidos de caseína como ejemplo para demostrar el aislamiento y la purificación de componentes bioactivos con un sistema compuesto por un puriFlash® 5.250 prepLC acoplado en línea a un exprensaion® detector de CMS. Esta combinación ofrece una mayor selectividad y sensibilidad en comparación con los detectores tradicionales como UV o ELSD, que pueden no responder de manera efectiva a los péptidos y proteínas objetivo bioactivos.


Advion Interchim Científico
puriFlash® 5.250


Advion Interchim Científico
exprensaion® CMS

Método
Preparación del aislado de proteína de suero
• El procedimiento de aislamiento de macropéptidos de caseína utilizado en esta aplicación se basa en el trabajo de Tadao Saito.[ 4 ] con algunas modificaciones.
• Se combinó una muestra de 50 g de aislado de proteína de suero de leche comprado en una tienda local con 500 ml de una mezcla de disolventes de 70 % de agua y 30 % de metanol (v/v). La mezcla se sonicó a 70°C durante 90 minutos y luego se filtró a presión reducida.
• El filtrado resultante se concentró a un volumen de 300 mL mediante la eliminación de metanol utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida a 40 °C. Luego se almacenó a 4°C durante una hora. Posteriormente, se añadió a la solución un volumen igual de etanol frío y la mezcla se agitó durante 5 minutos antes de almacenarla a 4 °C durante 4 horas más.
• La mezcla se filtró a presión reducida utilizando un filtro de 0.5 μm. Luego, el filtrado final se concentró hasta un volumen de 50 ml utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida.
• Una alícuota de 100 μL del extracto concentrado se mezcló con 900 μL de desionizado (DI)
agua para análisis HPLC/MS analíticos.
• El filtrado restante se usó para la purificación de péptidos usando el puriFlash® 5.250 Sistema PrepLC junto con un exprensaion® detector de CMS.

Tabla 1: Configuración del método HPLC/MS analítico

Configuración del método HPLC/MS analítico
El extracto líquido del aislado de proteína de suero se analizó por primera vez con un AVANT® Se desarrolló un sistema HPLC/CMS y un método de separación por cromatografía para la columna de 4.6 mm utilizada (Tabla 1).

La figura 1a muestra el cromatograma HPLC/MS del extracto líquido. Los espectros de MS promediados desde el pico a los 6.44 min indican que el compuesto es un péptido de carga múltiple con al menos cinco masas en m / z 755.2, 849.4, 970.6, 1132.1 y 1358.6 (Figura 1b) formando un perfil de carga.

A través de la deconvolución de carga del software, se determinó que la masa no cargada del péptido era 6787.4 Da, lo que indica macropéptido B de caseína (CMPb, masa teórica de 6787 Da) (Figura 1c).


Advion Interchim Científico
AVANT® (U) HPLC


Figura 1: (a) Cromatograma de HPLC/MS del extracto líquido del aislado de proteína de suero, (b) Los espectros de MS promediados del pico a TA 6.44 min, (c) La masa desconvolucionada y sin carga del pico de elución del péptido a TA 6.44 min.


Figura 2: (a) Cromatograma de HPLC/MS del extracto líquido del aislado de proteína de suero, (b) Los espectros de MS promediados del pico a TA 11.02 min, (c) La masa desconvolucionada y sin carga del péptido que eluye a TA 11.02 min.

Los espectros de MS promediados obtenidos del pico que eluyó a los 11.02 min sugieren que el compuesto también es un péptido de carga múltiple con masas en m/z 751.5, 845.4, 966.1, 1126.8 y 1352.1 (Figura 2b) que forman su perfil de carga.

De manera similar, la desconvolución de carga determina que la masa sin carga de este péptido es de 6755.3 Da, lo que indica la variante A del macropéptido de caseína, CMPa con una masa teórica de 6755 Da (Figura 2c).


Advion Interchim Científico
puriFlash® 5.250, divisor MS y exprensaion® CMS

Cromatografía PrepLC/MS
En un paso siguiente, el método de separación analítica se transpuso a la escala de preparación más grande de una columna de 4.6 mm de DI a una columna de 30 mm de DI y se optimizó aún más para la purificación de los dos CMP (caseína glico-macropéptidos) en el puriFlash® 5.250 Sistema PrepLC/Flash acoplado online al exprensaion® detector de CMS.

El cromatograma PrepLC-UV/MS del aislado de proteína de suero se muestra en la Figura 3 y los parámetros se muestran en la Tabla 2.

La recolección de fracciones se activó en función de la señal de MS, elegida por su mayor selectividad y sensibilidad. Se usó XIC de 970-971 Da para detectar CMPb y XIC de 965-966 Da para CMPa.

El solvente orgánico en la combinación de las fracciones 11-17 y la fracción 18-22 se eliminó usando un evaporador rotatorio bajo presión negativa, y el resto acuoso
La solución se secó usando un liofilizador LABCONCO Freezone 2.5L (-50 C), lo que resultó en una colección seca de 10 mg cada uno, que luego se disolvió en 10 ml de agua desionizada para el posterior análisis HPLC/UV/MS. Los resultados del análisis de pureza se muestran en las figuras 4 y 6.

Tabla 2: Configuración del método PrepLC/MS


Figura 3: El cromatograma PrepLC-UV/MS de dos aislados de proteína de suero

Resultados

Análisis de pureza de CMPb
El análisis de pureza de CMPb en las fracciones combinadas 11 a 17 se muestra en la Figura 4. El análisis de MS muestra que se detectaron cuatro iones principales con m/z en 970.8, 1132.3, 1358.6 y 1968.2 (Figura 4b).

Con los espectros de masas promediados de la Figura 4b, se determinó que la masa sin carga del pico a los 5.94 min era 6788.4 (CMPb, Figura 4c). Sin embargo, el análisis de MS también puede detectar cuatro componentes menores en 6758.3, 6773.5, 6804.8 y 6868.4 Da.

La pureza UV obtenida de CMPb es del 86.7 % (Figura 4d), pero, según los datos de MS adicionales, la pureza del compuesto es en realidad menor que eso (80 % estimado).

Se midió que el CMPa en las fracciones agrupadas 18 a 22 era del 94.7 % (figura 5a) según el análisis UV de la serie analítica.

El análisis de masa sin carga desconvolucionada muestra la masa dominante esperada de 6756.2 de CMPa (figura 5b) y un componente menor en 6774.6, una forma oxidada de CMPa.

De nuevo, este ejemplo muestra el valor de la detección por MS de compuestos bioactivos como péptidos y proteínas, y la mejor especificidad de la detección por MS en comparación con la UV.


Figura 4: (a) El cromatograma HPLC-MS de fracciones agrupadas de 11-17, (b) Espectros de MS promediados del pico eluyendo a TA 5.94 min, (c) la masa sin carga de (b), (d) El cromatograma HPLCUV de fracciones agrupadas del 11 al 17.


Figura 5: (a) El cromatograma HPLC-UV de fracciones agrupadas de 18-22. (b) masa desconvolucionada sin carga de CMPa.

La pureza total final se estima en aprox. 90%, un valor excelente para una molécula bioactiva en el descubrimiento de fármacos.

Se puede lograr una mayor mejora en la pureza con fracciones selectivas, a costa del rendimiento. Por ejemplo, el análisis HPLC-UV/MS de la fracción 20 de CMPa (Figura 6a) muestra una pureza UV del 99.0 % (Figura 6d) y ningún subproducto oxidado en el análisis MS.


Figura 6: (a) el cromatograma HPLC-MS de la fracción 20, (b) espectros de MS promediados del pico a TA 5.71 min, (c) masa desconvolucionada sin carga de CMPa (d) el cromatograma HPLCUV de las fracciones 20.

Conclusión
El puriFlash® 5.250 Sistema PrepLC/Flash, acoplado en línea con un exprensaion® El detector CMS logra un rendimiento sobresaliente, facilitando la purificación selectiva de macropéptidos bioactivos de una matriz compleja con un alto nivel de confianza. En comparación con los detectores UV o ELSD, el espectrómetro de masas ofrece una selectividad y sensibilidad superiores.

Una aplicación ilustrativa de este enfoque muestra el aislamiento de macropéptidos de glicol de caseína, lo que da como resultado un rango de pureza del 80 % (CMPb) al 90 % (CMPa) a través de fracciones combinadas con alto rendimiento. Se puede lograr una pureza aún mayor de hasta el 99.0 % con fracciones selectivas.

 

Referencias

[ 1 ]Gräslund, S., et al. (2008). Producción y purificación de proteínas. Métodos de la naturaleza, 5(2), 135-146.
[ 2 ]Procesamiento biofarmacéutico: desarrollo, diseño e implementación de procesos de fabricación.
[ 3 ]Lin T., et al. (2021) Bioactivos en la leche bovina: química, tecnología y aplicaciones Nutrition Reviews v79(S2):48–69
[ 4 ]Saito T. y otros. (1991) Un nuevo método de aislamiento de caseinoglicopéptido del suero de queso dulce. J. Ciencias de la leche. 74, 2831-2837

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Análisis de sangre con Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS

Introducción

Los oligoelementos son esenciales para las funciones biológicas adecuadas en los seres humanos, y los diferentes niveles de oligoelementos son indicativos de muchas enfermedades y afecciones. Los oligoelementos no esenciales también están presentes en el cuerpo humano como resultado de contaminantes ambientales generados por actividades humanas o industriales depositados en el suelo, el aire, el agua y los alimentos. Estos oligoelementos esenciales y no esenciales se miden y controlan fácilmente en sangre, suero y orina mediante ICP-MS.

En esta nota de aplicación, presentamos un método rápido para el análisis de rutina de muestras de sangre de pequeño volumen para elementos esenciales y tóxicos clave utilizando SOLATION® Espectrómetro de masas de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) que usa una preparación de muestra simple de "diluir y disparar". La alta sensibilidad y el amplio rango dinámico de ICP-MS son particularmente importantes para la determinación de niveles de trazas de metales pesados, al mismo tiempo que se miden elementos nutricionalmente relevantes en niveles más altos. La sangre es una matriz compleja, rica en proteínas y sales que favorecen la formación de interferencias a base de carbono y cloro que afectan a muchos de los analitos. La celda de colisión en SOLATION de Advion Interchim Scientific® ICP-MS es necesario para superar esas interferencias.

La SOLACION® ICP-MS tiene una celda de colisión octupolar que se utiliza para abordar las interferencias de los iones poliatómicos, especialmente para los elementos de metales de transición. Es fundamental para un análisis de elementos traza robusto y rutinario que la celda del octupolo no se contamine, lo que podría causar deriva y tiempo de inactividad innecesario. Los iones que pasan a través de la interfaz se dirigen a través de un giro de 90˚ y se enfocan hacia la entrada del octupolo usando un deflector de cuadrupolo (QD). Las partículas ligeras y neutras continúan a través del QD y se alejan de la célula.

La celda de colisión en la SOLACIÓN® El ICP-MS puede funcionar en el modo "He Gas", en el que la celda se llena con He para que actúe como gas de colisión, o en el modo "Sin gas", en el que la celda está vacía. El modo “He Gas” se utiliza para isótopos sujetos a interferencias poliatómicas mientras que el modo “No Gas” se utiliza para el resto de isótopos. El cambio rápido entre los modos "He Gas" y "No Gas" en SOLATION® (< 5 seg) garantiza que las corridas analíticas se mantengan cortas, mejorando así la productividad.

Experimento y resultados

reactivos y materiales

Ácido nítrico (Aristar Plus, grado de metales traza)
Triton X-100 (especialmente purificado, producto químico de Roche)
Agua, tipo 1 (18.2 MΩ, sistema de punto de uso Elga)
Metanol (hipergrado para LC-MS, Supelco)
Soluciones estándar de Mg, Ca, Mn, Cu, As, Se, Cd, Pb, Ge, Rh, Au e Ir (1000 μg/ml, grado Claritas ppt) 
Oligoelementos Sangre entera L-1 (SRM1) (Seronorm)
Oligoelementos Sangre entera L-2 (SRM2) (Seronorm)
Oligoelementos Sangre entera L-3 (SRM3) (Seronorm)
Sangre entera en blanco (WB(F)) (UTAK)
Diluyente ácido: (0.5 % de ácido nítrico, 0.05 % de Triton X-100, 2 % de metanol, 0.25 μg/mL (ppm) Au y los estándares internos: 10 μg/L (ppb) Ge, Rh e Ir)

Tabla 1: Calibración y concentraciones estándar

Estándares

El método fue desarrollado para determinar Mg, Ca, Mn, Cu, As, Se, Cd y Pb en muestras de sangre total. Los elementos se eligieron para representar algunos de los metales comúnmente medidos en la sangre, cubriendo tanto elementos esenciales como tóxicos. Los estándares se prepararon usando el diluyente ácido con elementos en cuatro niveles de concentración para cubrir el rango típicamente observado en la sangre. La Tabla 1 describe las concentraciones estándar en cada nivel y qué elementos se encuentran en ese nivel. El modo de análisis y el estándar interno utilizado para cada analito se encuentran en la Tabla 2. Las pautas de la ICH exigen un mínimo de cinco concentraciones para establecer la linealidad; con el blanco de calibración usamos seis, satisfaciendo este requisito.

Tabla 2: Modo de Análisis y Estándares Internos

Muestras y Preparación

Las muestras se prepararon en tubos de centrífuga sin metal de 15 ml. Se añadió diluyente ácido (14.7 ml) a cada tubo, seguido de 0.3 ml de muestra de sangre para una dilución de 1:50. Los tubos se taparon y se invirtieron de 3 a 5 veces para mezclar bien.

Las muestras se analizaron mediante un SOLATION® ICP-MS. La SOLACION® La configuración del instrumento para este análisis fue una cámara de pulverización ciclónica con un nebulizador concéntrico Micromist y una antorcha de una pieza. Durante todo el estudio se utilizaron conos de muestreo y skimmer de Ni. Las condiciones de funcionamiento del instrumento se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Parámetros de funcionamiento de ICP-MS

Resultados y Discusión

Seguimos las pautas de "Validación de procedimientos analíticos" de ICH para la validación de métodos que definen requisitos específicos de exactitud, precisión (repetibilidad), límite de detección y límite de detección del método (DL y MDL) y límites de cuantificación (LOQ). 

La precisión del método se estableció utilizando los materiales de referencia Seronorm, que tenían valores de concentración certificados para todos los elementos del método. Estos materiales se midieron por triplicado y los resultados analíticos se compararon con los valores certificados y los límites de confianza del 95 % proporcionados por Seronorm. 

Estos valores se trazan en la Figura 1, donde los valores mínimos y máximos certificados se representan como un recuadro. Nuestros valores analíticos se trazan en la Figura 1 y, en todos los casos, nuestros valores se encuentran dentro de los límites que indican un alto grado de precisión que cumple fácilmente con las especificaciones de ICH.

Una segunda medida de precisión es la recuperación de picos. La muestra de "sangre en blanco" (WB(F)) de UTAK se enriqueció con 150 μL de la solución estándar madre para todos los elementos excepto Ca y Mg en el tubo de 15 mL. La recuperación se calcula como: 

Las recuperaciones de picos se muestran en la Tabla 4. Todas las recuperaciones se encuentran entre el 90 y el 110 %, lo que indica una recuperación excelente de los analitos enriquecidos.

Tabla 4: Recuperaciones de picos

La precisión del método se mide como la repetibilidad de seis muestras de Seronorm nivel 2 (SRM2). Se prepararon, diluyeron y analizaron individualmente seis muestras de Seronorm nivel 2 (SRM2). Los resultados muestran menos del 3 % de RSD entre las réplicas. El % RSD de las seis réplicas se presenta en la Figura 2.


Figura 1 y XNUMX: Exactitud del análisis de material Seronorm certificado


Figura 2 y XNUMX: Precisión del análisis de materiales Seronorm

El límite de detección del método (MDL) y el límite de cuantificación (LOQ) se determinaron usando la desviación estándar (σ) de la señal de ocho blancos de diluyente ácido. Los blancos de diluyente ácido se prepararon utilizando la misma técnica y equipo que las muestras y se incluyeron al final de cada ciclo, seguidos de un estándar de calibración. El MDL y el LOQ se calculan como: 

donde S es la pendiente de calibración, y:

Dado que la pendiente de calibración era el analito en relación con un estándar interno, se utilizó el estándar de calibración para determinar los recuentos/segundo/ppb. Estos valores se calculan, se multiplican por 50 para tener en cuenta el factor de dilución y se expresan en μg/L (ppb). En la tabla, el MDL y el LOQ se trazan en relación con los valores normales fisiológicos representados por Seronorm 2 (SRM2). Para la mayoría de los analitos, el MDL y el LOQ son minúsculos en comparación, particularmente para los elementos principales calcio y magnesio. Sin embargo, incluso para analitos más desafiantes como el selenio, el MDL es un orden de magnitud menor que el Seronorm 2 (SRM2) que, a pesar de ser el nivel 2 (SRM2), tiene el contenido de selenio más bajo de estos tres SRM. 


Figura 3 y XNUMX: LOQ y MDL en comparación con los valores normales fisiológicos
*representado por Seronorm L2, formulado para representar valores humanos típicos o promedio.

Conclusión

En esta nota de aplicación, informamos sobre el análisis de oligoelementos en sangre utilizando Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS. La sangre es una matriz compleja y desafiante. Sin embargo, estos datos respaldan el uso de un método sencillo de preparación de muestras de "diluir y disparar" que brinda concentraciones exactas y precisas para elementos de nivel alto y traza en sangre. Se observaron recuperaciones excelentes tanto para las muestras enriquecidas como para los CRM. La combinación del deflector cuadripolar y la celda de colisión minimiza la deriva y garantiza la exactitud y la precisión a lo largo del tiempo. El método informado se beneficia de las capacidades de cambio de gas de celda de colisión rápida de SOLATION® para analizar una amplia gama de elementos en la sangre para obtener resultados rápidos, precisos y reproducibles.

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Análisis de Iohexol utilizando Advion Interchim Scientific AVANT™ HPLC y exprensaion® sistema CMS

Introducción

El iohexol es un agente de imagen no iónico ampliamente utilizado que mejora el contraste para el análisis de rayos X. Su baja osmolalidad permite un rápido aclaramiento a través del riñón, evitando la reabsorción y posterior metabolización.[ 1 ]. Esto convierte al iohexol en un compuesto con un mejor perfil de seguridad en comparación con otros agentes de diagnóstico por imágenes.[ 2 ]. 

En muchas aplicaciones de imágenes clínicas, los agentes de imágenes/agentes de contraste se administran a los pacientes para mejorar el contraste y la resolución espacial de la exploración. Debido a la toxicidad y los efectos secundarios del agente de formación de imágenes, las preparaciones de sus concentraciones conocidas y su análisis de pureza son muy importantes para su uso seguro y un diagnóstico preciso. 

En esta nota de aplicación, se presenta un método HPLC-CMS simple y preciso para el análisis de iohexol.

Método

Configuración del método

Todos los disolventes utilizados en la aplicación eran de grado HPLC.

Se obtuvieron dos estándares de Iohexol de Sigma Aldrich.

Uno era un material de referencia certificado con una pureza del 99.99 %, el segundo tenía una pureza declarada de ≥ 95 %.

Todos los experimentos se realizaron en un Advion Interchim Scientific exprensaion® Espectrómetro de masas compacto acoplado con un sistema UHPLC AVANT™ con parámetros como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Método HPLC/MS

Análisis HPLC/UV/MS de Iohexol

A temperatura ambiente, el iohexol se isomerizará y se detectarán dos picos en su análisis HPLC/UV/MS. 

Estos dos picos (Figura 1A) provienen de la rotación impedida del grupo anilida N-acetilo debido a los voluminosos átomos de yodo unidos al anillo de benceno central del iohexol. Esos dos compuestos son esencialmente "isómeros rotacionales" que se intercambian lentamente a temperatura ambiente en solución acuosa.

Ambos picos se confirman con el análisis de MS para mostrar la misma m/z a 821.9 (Figura 1B y 1C) y no se observaron diferencias en sus espectros de masas CID en la fuente (Figura 2A y 2B). 

Dado que ambos rotámeros contribuyen a la toxicidad de los compuestos y a las capacidades de mejora de la imagen en el análisis de rayos X, la suma de ambos picos se utilizará para cualquier análisis adicional de iohexol en esta nota de aplicación. 


Figura 1 y XNUMX: (A) cromatograma HPLC (254 nm) de iohexol, (B) el cromatograma iónico de extracción de iohexol protonado am/z 821.8, (C) los espectros de MS promediados desde el pico a RT 4.06 min.


Figura 2 y XNUMX: (A) Los espectros de masas CID en fuente promediados desde el pico a RT 3.61 min, (B) Los espectros de masas CID en fuente promediados desde el pico a RT 4.06 min.

Determinación de pureza por análisis HPLC/UV

Al comparar la respuesta de HPLC de la muestra de iohexol con la respuesta del estándar certificado de iohexol a una concentración similar, la relación del área del pico de la muestra al estándar certificado puede proporcionar un análisis rápido de concentración y pureza. 

La ecuación para calcular la relación de concentración de iohexol se muestra a continuación:

Los cromatogramas de HPLC de la muestra de iohexol y la referencia certificada se muestran en las Figuras 3A y 3B.

El valor promedio de las áreas de dos picos sumadas es 714 para la muestra de iohexol (Figura 3A) y 740 para el estándar de referencia de iohexol (Figura 3B). Con el cálculo de la relación de concentración, la concentración calculada de iohexol en la muestra es de 0.0964 mg/ml, lo que equivale a una pureza del 96.4 %, en línea con la pureza del producto declarada de ≥ 95 %.


Figura 3 y XNUMX: (A) Cromatograma HPLC (254 nm) de muestra de iohexol (0.1 mg/ml) (B) Cromatograma HPLC (254 nm) de patrón de referencia de iohexol (0.1 mg/ml).

Cuantificación por HPLC/Análisis UV

Para verificar la pureza de una muestra de iohexol con mayor precisión, se creó una curva de calibración del material estándar certificado de iohexol con cinco niveles de dilución diferentes de 25 a 500 μg/mL y con inyecciones por triplicado para cada concentración. El valor R-cuadrado de la función de calibración lineal resultante es 0.9999 (Figura 4), lo que muestra una linealidad excelente. 

Mediante el enfoque de la curva de calibración de iohexol, se determinó que la pureza de la muestra de iohexol era del 97.5 %. 

Este valor también está justo por encima de la pureza indicada de un mínimo del 95 % de la muestra y difiere en solo un 1.1 % del valor medido mediante el análisis directo de la relación de respuesta UV de la muestra de iohexol al estándar de referencia de iohexol.

Tanto la determinación de la pureza mediante una función de calibración como el análisis directo de la relación de respuesta UV se pueden utilizar para productos químicos orgánicos con absorbancias UV si se dispone de material estándar de referencia certificado.

El método de la función de calibración proporcionará una medición más precisa.


Figura 4 y XNUMX: Curva de calibración de iohexol por cromatograma HPLC (254 nm)

Conclusión

El sistema Advion Interchim Scientific AVANT™ (U)HPLC puede proporcionar métodos cromatográficos precisos para el análisis de pureza de los agentes de formación de imágenes, como se muestra para el iohexol. Acoplamiento de UHPLC con Advion Interchim Scientific exprensaion® El espectrómetro de masas compacto no solo proporciona confirmaciones de compuestos objetivo a través de su masa y patrón de fragmentación en la fuente, pero también permite una rápida determinación de las impurezas. 

Referencias
[ 1 ] T. Almen, Desarrollo de medios de contraste no iónicos., Invest. Radiol. (1985) Radiología de investigación. 1985, 20(1), S2-S9.
[ 2 ] RD Moore, EP Steinberg, NR Powe, RI White, JA Brinker, EK Fishman, SJ Zinreich, CR Smith, Frecuencia y determinantes de las reacciones adversas inducidas por medios de contraste de alta osmolalidad, Radiología. 1989, 170, 727-32.

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Extracción y purificación de 3 curcuminoides a partir de polvo de cúrcuma

Instrumentación:
Destello: puriFlash® XS520
Cuidado y cariño: Plate Express™ Lector de placas TLC
Espec. de masa: exprensaion® Espectrómetro de masas compacto
Muestreo: Lo antes posible® Sonda de análisis directo

Introducción

Los curcuminoides son compuestos de polifenoles naturales derivados de la raíz de cúrcuma (Curcuma longa). Se informa que tienen actividades antioxidantes.1. La curcumina es el principal curcuminoide que se encuentra en la cúrcuma. Se usa comúnmente como ingrediente en suplementos dietéticos y cosméticos, saborizante en platos culinarios y colorante alimentario de color amarillo anaranjado.

En esta nota de aplicación, un método para separar y purificar 3 curcuminoides del polvo de cúrcuma mediante cromatografía flash con Advion Interchim Scientific puriFlash® XS520 Plus, TLC con espectrometría de masas con Plate Express™ TLC Plate Reader y exprensaion® Se demuestra CMS. Las fracciones se identificaron utilizando la sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP®).

Extracción de curcuminoides

El polvo de cúrcuma se pesó (57.3 g) y se transfirió a una botella de vidrio de boca ancha. Se añadió etanol (250 ml, graduación 200) a la botella y la mezcla se agitó durante 18 horas mientras se tapaba con papel aluminio. Los compuestos de interés son sensibles a la luz. A continuación, la suspensión se filtró y el filtrado se concentró a sequedad para formar un aceite de color ámbar (6.4 g).

Figura 1: Estructuras de curcuminoides.

Figura 2: Polvo de cúrcuma comprado en la tienda (izquierda) y aceite de extracto crudo (derecha).

Análisis TLC/MS

El Advion Interchim Scientific Plate Express™ combinado con el exprensaion® CMS permite una fácil identificación de puntos en placas de TLC sin necesidad de purificación o preparación de muestras (Figura 3).

El análisis TLC inicial mostró 4 puntos (diclorometano:metanol, 97:3). Los tres puntos inferiores eran muy fluorescentes, como se esperaba para los curcuminoides de interés. Los puntos de TLC se analizaron mediante ionización APCI en modo de iones negativos. Los 3 puntos inferiores se caracterizaron por espectrometría de masas.

Figura 3: Advion Interchim Scientific exprensaion® Lector de placas TLC CMS y Plate Express™ (izquierda) y primer plano del cabezal de extracción de placas TLC (derecha).

Figura 4: Placa TLC revelada visualizada a 365 nm. Espectros de masas resultantes de curcumina (arriba), demetoxicurcumina (centro) y bisdemetoxicurcumina (abajo).

Purificación instantánea

Se usó un método isocrático ya que la separación que se muestra en TLC era óptima tal cual. El material bruto se purificó en una columna de gel de sílice esférica de 25 g y 15 μm (PF-15SIHC-F0025). Se cargó en seco un peso bruto de 64 mg en 500 mg de gel de sílice y se cargó en un cartucho de carga seca de 4 g (PF-DLE-F0004).

Figura 5: Cromatograma flash resultante de la placa TLC desarrollada.

Identificación de fracciones por ASAP®/CMS

La exprensaion® CMS con el ASAP® La sonda de análisis directo permite una fácil identificación de compuestos sin necesidad de LC/MS o preparación de muestras.

Las fracciones puras (1.1, 1.3 y 1.5) se analizaron utilizando el ASAP® sonda con ionización APCI y CMS de polaridad positiva. Sin embargo, los curcuminoides se ionizan bien tanto en polaridad positiva como negativa de APCI (M+H)+ los iones mostraron menos fragmentación. Las masas detectadas son consistentes con el teórico [M+H]+ valores m/z.

Figura 6: Advion Interchim Scientific lo antes posible® La sonda de análisis directo se inserta directamente en la fuente de iones habilitada para APCI del exprensaion® CMS.

Figura 7: Espectros de masas de fracciones.

Las fracciones purificadas se concentraron a sequedad para dar los sólidos I (14.1 mg), II (5.6 mg) y III (6.7 mg) respectivamente, que representan curcumina (I), demetoxicurcumina (II) y bisdemetoxicurcumina (III) al 53.4 %. 21.2%, y 25.3% del perfil curcuminoide aislado. Estos resultados son consistentes con los valores reportados en la literatura.2.

Confirmación de la pureza del compuesto por RP-HPLC

Figura 8: Escaneo UV de la mezcla de fracción purificada.

La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) permite una confirmación separada de la pureza del compuesto después de la cromatografía flash. Se combinó una mezcla igual de los tres compuestos y se ejecutó en un Phenomenex Kinetex® 5 μColumna de bifenilo m 100 Å 50 x 2.1 mm usando ACN isocrático:agua (v:v, 55:45) con ácido fórmico al 0.2%. Como era de esperar, el orden de elución de los tres curcuminoides cambió de orden ahora eluyendo III, II e I (Figura 8). Después de desarrollar este método, se inyectó la respectiva fracción única recolectada y se analizó la pureza y se confirmó nuevamente mediante análisis de MS.

Figura 9: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.1.

Figura 10: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.3.

Figura 11: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.5.

Conclusión

Con una combinación de cromatografía TLC, cromatografía flash y soporte de espectrometría de masas en varias etapas del proceso (identificación de placa TLC, confirmación de fracción y análisis de pureza secundario), podemos purificar curcuminoides a partir de polvo de cúrcuma a niveles de pureza confirmados de >95 %.

Referencias:
1Jayaprakasha et al. Actividades antioxidantes de la curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina. Food Chemistry, volumen 98, número 4, 2006, páginas 720-724. ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2Praveen et al. Enfoque sencillo de RMN para perfilar los curcuminoides presentes en la cúrcuma, Food Chemistry, volumen 341, parte 2, 2021, 128646, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.128646.

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Análisis de suelos con Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS

Introducción

Los contaminantes ambientales generados por las actividades humanas o industriales a menudo llegan al suelo a través de las aguas de escorrentía o la deposición del aire. Estos contaminantes pueden ser absorbidos por las plantas y avanzar en la cadena alimenticia, lo que puede tener impactos significativos en la salud humana y animal. Por lo tanto, no solo es importante monitorear los niveles de nutrientes esenciales en el suelo que son clave para el crecimiento saludable de las plantas, sino que también es imperativo monitorear los niveles de contaminantes.

En esta nota de aplicación presentamos un método para el análisis de rutina de 21 elementos usando SOLATION® Espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Se digirieron un grupo de muestras de suelo desconocidas y un CRM utilizando EPA 3051a y se analizaron de acuerdo con los requisitos del método 6020a.

Experimento

Reactivos y materiales
• Ácido nítrico (Aristar Plus, grado de metales traza)
• Ácido clorhídrico (Aristar Plus, grado de metales traza)
• Agua, tipo 1 (18.2 MΩ, sistema de punto de uso Elga o equivalente)
• NIST CRM2706 “Suelo de Nueva Jersey, Orgánicos y Oligoelementos”
• Solución multielemento Spex 'CL-ICV-1'
• Solución estándar de aluminio (1000 μg/ml, grado Claritas ppt)

Instrumentación
1. Anton Paar Multiwave 5000 con el rotor 20SVT50 (20 posiciones, recipientes de 50 ml que ventilan a 40 bar (580 psi)
2. Amoladora multifunción de alta velocidad OKF
3. Advion Interchim Scientific SOLACIÓN® ICP-MS

Estándares

Los estándares de calibración se prepararon en las mismas proporciones de ácido que las muestras digeridas (9mL HNO3+ 3 ml de HCl, o 3:1). Un litro de HNO al 3%3Se hizo + HCl al 1% como diluyente para los estándares, para la dilución final de las muestras y para usar como blanco de calibración.

Los estándares se hicieron utilizando la solución multielemento Spex 'CL-ICV-1' y el estándar de aluminio de un solo elemento. El aluminio se agregó por separado a la mezcla para dar cuenta de los altos niveles de este elemento en el suelo.

Muestras y Preparación

Se secaron cuatro muestras de suelo a 60°C durante la noche, luego se molieron finamente usando un molinillo multifunción de alta velocidad OKF para hacer una mezcla homogénea. Según el método EPA 3051a "Digestión ácida de sedimentos, lodos y suelos asistida por microondas", se transfirieron 0.5 g de cada muestra a recipientes de microondas y se mezclaron con 9 ml de ácido nítrico y 3 ml de ácido clorhídrico. A continuación, los recipientes se taparon y se hicieron funcionar utilizando el método descrito en la Tabla 1. Después de la digestión, las muestras se filtraron y se llevaron al volumen con agua desionizada en una volumétrica de 50 ml. Luego se diluyó una alícuota de 1.0 ml hasta un volumen final de 50 ml con el diluyente preparado para una dilución final nominal de 5,000x dependiendo del peso inicial de la muestra.

Tabla 1: Programa de digestión por microondas.

Para fines de control de calidad, las cuatro muestras de suelo desconocidas se prepararon como muestra, duplicado y espiga. Se digirieron de forma independiente donde los dos primeros se usaron para comparar la repetibilidad de la preparación de la muestra, mientras que el tercero se añadió antes de la digestión para establecer la recuperación del analito del procedimiento de digestión.

Para verificar la precisión de los resultados, incluimos el material de referencia estándar, NIST 2706 "Suelo, compuestos orgánicos y elementos traza de Nueva Jersey", que incluye valores certificados para todos los analitos informados en este estudio.

Las muestras se analizaron mediante un SOLATION® ICP-MS. La SOLACION® configuración del instrumento para este análisis fue una cámara de pulverización ciclónica con un Micromist® nebulizador concéntrico y una antorcha de una pieza. Durante todo el estudio se utilizaron conos de muestreo y skimmer de Ni. Los parámetros de operación del plasma fueron:

Tabla 2: Parámetros de funcionamiento del plasma.

Método ICP-MS

Integral a la SOLACIÓN® ICP-MS es una celda de colisión octupolar que se utiliza para abordar las interferencias de los iones poliatómicos, especialmente para los elementos de metales de transición. Es fundamental para un análisis de elementos traza robusto y rutinario que la celda del octupolo no se contamine, lo que podría causar deriva y tiempo de inactividad innecesario. Por lo tanto, el camino iónico de la SOLACIÓN® ICP-MS fue diseñado para tener la celda de colisión fuera de la línea directa del plasma. Los iones que pasan a través de la interfaz se dirigen a través de un giro de 90 ̊ y se enfocan hacia la entrada del octupolo usando un deflector de cuadrupolo (QD). Las partículas ligeras y neutras continúan a través del QD y se alejan de la celda.

La celda de colisión en la SOLACIÓN® El ICP-MS puede funcionar en el modo "He Gas", en el que la celda se llena con He para que actúe como gas de colisión, o en el modo "Sin gas", en el que la celda está vacía. El modo “He Gas” se utiliza para isótopos sujetos a interferencias poliatómicas mientras que el modo “No Gas” se utiliza para el resto de isótopos. El cambio rápido entre los modos "He Gas" y "No Gas" en SOLATION® (< 5 seg) garantiza que las corridas analíticas se mantengan cortas, mejorando así la productividad.

El flujo de helio utilizado para el modo “He Gas” en esta aplicación fue de 6 ml/min. La Tabla 3 enumera los elementos utilizados para este análisis y sus isótopos, y el modo utilizado para cada uno.

Tabla 3: Una lista de los elementos incluidos en este estudio junto con sus isótopos y el modo de gas utilizado para el análisis.

Resultados y discusión

Los resultados resumidos en la Figura 1 muestran una excelente concordancia entre los datos medidos para CRM2706 y los niveles extraídos informados para estos elementos. Se observó una recuperación ligeramente mayor para K y Al, posiblemente debido a la variabilidad en la eficiencia de extracción de este método de digestión.

Figura 1 y XNUMX: Datos de recuperación de materiales de referencia certificados.

Como se muestra en la Tabla 4, las recuperaciones de pico promediaron entre 75% y 125% para todos los elementos, con la excepción de Al; Esto probablemente se debió al pequeño tamaño del pico en comparación con los niveles de Al en las muestras. Incluidos en la misma tabla están los resultados de las digestiones/análisis por duplicado para estos elementos. En promedio, los duplicados tenían una diferencia de menos del 20 % y la mayoría de los elementos mostraban una excelente repetibilidad de <5 %.

Tabla 4: Recuperaciones promedio de picos y repetibilidad por duplicado para las diversas muestras.

Resumen

En este informe de aplicación, informamos sobre el análisis de oligoelementos en el suelo utilizando Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS. Se observaron recuperaciones excelentes tanto para las muestras enriquecidas como para los CRM. La combinación del deflector cuadripolar y la celda de colisión minimiza la deriva y garantiza la exactitud y la precisión a lo largo del tiempo. El método informado se beneficia de las capacidades de cambio de gas de celda de colisión rápida de SOLATION® para analizar una amplia gama de elementos en el suelo para obtener resultados rápidos, precisos y reproducibles.

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Colección de fracciones dirigidas a la masa de productos naturales: ejemplos de extracto de cúrcuma y té verde

Flash: PuriFlash® 5.250
Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: lo antes posible® sonda

Introducción

La cromatografía ultrarrápida ha utilizado tradicionalmente la absorción UV como método principal de detección de compuestos durante un proceso de purificación. Mientras que la absorción UV es ampliamente aplicable a muchas clases de compuestos, tiene una especificidad limitada para los compuestos individuales en una mezcla y pasa por alto las clases de compuestos que no llevan cromóforos.

La recolección de fracciones dirigida por masa brinda a los usuarios la capacidad de recolectar fracciones basadas en la detección de espectrometría de masas (MS), que se basa en iones específicos de compuestos individuales y proporciona información molecular específica. Esto permite la simplificación del proceso de purificación general y una mayor confianza en la identidad de cada compuesto aislado.

Aquí describimos métodos para aislar productos naturales a partir de té verde y polvo de cúrcuma mediante la recolección de fracciones dirigidas a la masa durante la cromatografía flash y la CL preparativa. Con fines de demostración, los compuestos aislados se confirmaron adicionalmente mediante la sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP®) MS o HPLC-MS.

Introducción a los curcuminoides

La curcumina es el principal curcuminoide que se encuentra en la raíz de la cúrcuma (Curcuma longa). Se usa comúnmente como ingrediente en suplementos dietéticos y cosméticos, saborizante en platos culinarios y colorante alimentario de color amarillo anaranjado. Se ha informado que los curcuminoides tienen actividades antioxidantes y antiinflamatorias.

El polvo de cúrcuma comprado en la tienda (57.3 g) se extrajo en etanol, luego se filtró a través de papel de filtro y se concentró. Esto produjo un aceite de extracto crudo de 6.4 g que contenía los tres curcuminoides de interés (compare también el análisis de TLC en la Figura 4).


Figura 1 y XNUMX: Estructuras de los curcuminoides de interés.


Figura 2 y XNUMX: Polvo de cúrcuma comprado en la tienda.


Figura 3 y XNUMX: Aceite de extracto crudo de polvo de cúrcuma.


Figura 4 y XNUMX: Análisis TLC a 365 nm de extracto de cúrcuma (97:3 DCM:MeOH) y el cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección UV.

Desarrollo de métodos

El extracto de cúrcuma se analizó primero en una placa TLC y luego el método se transfirió al puriFlash® Sistema 5.250 que utiliza detección UV en dos longitudes de onda. Se detectaron cuatro compuestos a 254 nm con tres supuestos curcuminoides detectados a 427 nm, sin embargo, no hay especificidad para los compuestos individuales en la detección UV.

Se utilizó un método isocrático (97:3 diclorometano:metanol) ya que la separación mostrada en TLC fue óptima. El material bruto se purificó en una columna de gel de sílice esférica de 12 g y 15 μm (PF-15SIHC-F0012). Se cargó en seco un peso bruto de 32 mg en 250 mg de gel de sílice y se cargó en un cartucho de carga seca de 4 g (PF-DLE-F0004). Las fracciones se recolectaron usando los canales XIC para cada compuesto de interés.


Figura 5 y XNUMX: Captura de pantalla del método de cromatografía flash ejecutado con parámetros.

Los ajustes del espectrómetro de masas se controlan a través de InterSoft®Software X en el puriFlash® sistema. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente APCI y funcionó con el modo de adquisición de ionización negativa.


Figura 6 y XNUMX: Captura de pantalla de los parámetros del espectrómetro de masas para la ejecución de la cromatografía.

Experimento

Colección de fracciones dirigidas a masas

El cromatograma de iones extraídos (XIC) creado al graficar la intensidad de la señal observada en un valor elegido de masa a carga. Esto permite una señal de bajo ruido de los compuestos de interés. Aquí los canales XIC están configurados para detectar los tres curcuminoides de interés.


Figura 7 y XNUMX: Análisis TLC del extracto de cúrcuma (97:3 DCM:MeOH) y cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección MS XIC.




Figura 8 y XNUMX: Los espectros de masas para cada pico proporcionados por el puriFlash® intersoft®programa X.

Lo antes posible® Confirmación de fracciones MS

Las fracciones puras (1.1, 1.2 y combinadas 1.3 y 1.4) se analizaron adicionalmente usando ASAP® EM de polaridad negativa. Las masas detectadas son consistentes con los valores teóricos [MH]-m/z.




Figura 9 y XNUMX: Los espectros de masas de los compuestos aislados confirmando su identidad y pureza.

Introducción, Catequinas del té verde

El té verde seco generalmente consta de 10 a 30 % de polifenoles en base al peso seco, siendo las catequinas los principales polifenoles del té, incluidos: (-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), (-) -epicatequina-3-galato (ECG) y (-)-galocatequina galato (GCG). EGCG es la catequina más abundante y biológicamente activa, la separación y purificación de las catequinas del extracto de té crudo puede aumentar considerablemente su disponibilidad y valor en el mercado.

Las hojas secas de té verde se extrajeron en agua caliente, luego se repartieron con acetato de etilo, se filtraron a través de papel de filtro y se evaporaron para dar un extracto crudo. Luego, el extracto seco se disolvió en 7.5 ml de agua y se filtró con un filtro de 0.2 μm antes de continuar con el procesamiento.


Figura 10 y XNUMX: Hojas de té verde en remojo.


Figura 11 y XNUMX: Principales catequinas en el té verde.

Desarrollo de métodos
Con el análisis HPLC-UV/MS, se detectan EGC, EGCG, GCG, EC y ECG en el extracto de té (Figura 12).

Disolvente A: Agua
Disolvente B: Metanol
ultravioleta: 275nm
MS: escaneo completo de 150-900
Columna: US15C18HP-250/046


Figura 12 y XNUMX: Se utilizó el cromatograma HPLC-UV del extracto de té verde, datos de MS y un estándar para EGCG para la confirmación del compuesto (datos no mostrados).

Los ajustes del espectrómetro de masas se controlan a través de InterSoft®Software X en el puriFlash® sistema. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente ESI y funcionó con el modo de adquisición de ionización negativa.


Figura 13 y XNUMX: Captura de pantalla de los parámetros del espectrómetro de masas para la ejecución de la cromatografía.

Colección de fracciones dirigidas a masas
Aquí los canales XIC están configurados para detectar las 4 catequinas de interés. EGCG y CGC son isómeros y por lo tanto comparten la misma masa.


Figura 14 y XNUMX: Cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección MS XIC.


Figura 15 y XNUMX: Los espectros de masas para cada pico proporcionados por InterSoft®programa X.

Conclusión

• Con el aislamiento de productos naturales, uno de los mayores desafíos es la identificación de compuestos de interés en mezclas de extractos complejos.
• Usando MS y cromatografía en tándem, podemos separar e identificar compuestos en una mezcla compleja con un alto grado de pureza y precisión sin necesidad de una mayor identificación de las fracciones recolectadas.
• Las fracciones recolectadas se pueden caracterizar directamente a través de los datos de MS proporcionados por InterSoft®Software X en el puriFlash® .
• El puriFlash® 5.250 y exprensaion® CMS forma un poderoso dúo en la purificación e identificación de productos naturales como las catequinas que se encuentran en el té verde y los curcuminoides que se encuentran en la cúrcuma.

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Purificación de alto rendimiento de cinco compuestos de medicamentos recetados y de venta libre mediante LC-MS preparativa de fase inversa

Instrumentación:

puriFlash® 5.250
exprensaion® CMS
Uptisfera® Columna StrategyTM US5C18HQ-150/300

Escritores:

Advion Interchim Scientific, Montluçon, Francia Sede

 

Introducción

La purificación es un paso crítico en el desarrollo de fármacos. Desde la investigación hasta la ampliación y el procesamiento, la purificación y la confirmación son pasos esenciales para llevar un fármaco al mercado. Es esencial contar con una solución de alto rendimiento que ofrezca una cantidad suficiente y una calidad reproducible de compuestos purificados. La separación de los ingredientes farmacéuticos activos (API) de sus impurezas se puede lograr fácilmente con un sistema de cromatografía preparativa.

Esta nota de aplicación presenta la purificación de cinco ingredientes activos que se encuentran en los medicamentos de venta libre (OTC), incluidos la cafeína, la glafenina, el ketoprofeno, la flavona y el fenofibrato (Figura 1), mediante un flujo de trabajo de purificación preparativa con confirmación mediante un espectrómetro de masas compacto.

Figura 1: Los cinco compuestos de interés incluyen cafeína, glafenina, ketoprofeno, flavona y fenofibrato. Las estructuras químicas y los casos de uso farmacéutico se destacan a continuación.

Cafeína: Una sustancia química natural con efectos estimulantes, la cafeína se puede encontrar purificada en forma de tabletas o de forma natural en el café, el té, el cacao y más.

Glafenina: Un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), la glafenina, se retiró del mercado en 1991 debido al alto riesgo de anafilaxia.

Ketoprofeno: Un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) de venta con receta, el ketoprofeno se utiliza para tratar inflamación, hinchazón, rigidez y dolor en las articulaciones. El medicamento se suspendió en 1995 debido al aumento del riesgo de ataque cardíaco, accidente cerebrovascular, irritación y otros problemas.

Flavona: Un metabolito y nematicida que existe comúnmente en las plantas.

Fenofibrato: Medicamento recetado que se usa para reducir y tratar los niveles altos de colesterol y triglicéridos (sustancias similares a las grasas) en la sangre.

Experimento

Separación LC exploratoria

Figura 2: Para confirmar la presencia de los compuestos preidentificados, una serie LC-UV exploratoria confirmó la presencia de los compuestos farmacológicos antes de la purificación.

Ejecución de LC preparativa

Después de la identificación positiva de los cinco compuestos de interés y sus puntos de elución, la mezcla de fármacos estaba lista para una ejecución preparatoria de LC-UV en el puriFlash.® 5.250 iELSD. El paquete iELSD ayuda a la purificación, lo que permite la detección de compuestos libres de cromóforos (Figura 3).

Resultados y Validación

Resultados de separación y purificación

La identidad de los compuestos separados se confirmó utilizando el Advion Interchim Scientific exprensaion® Espectrómetro de masas compacto, que identifica de forma rápida y precisa los compuestos de interés.

La pureza de estos compuestos se puede verificar mediante HPLC a escala analítica.

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SOLATION®, un nuevo ICP-MS para la detección de metales pesados ​​en el cannabis y el cáñamo

Introducción

Los productos de cannabis y cáñamo son cada vez más Hoy Disponibles para uso medicinal y recreativo hacer pruebas de rutina para metales pesados ​​tóxicos mucho mas importante.  Advion Interchim Scientific presenta SOLATION® ICP-MS para el analisis de metales pesados ​​en muestras de plantas de cannabis y productos de cannabis. Si bien no existen pautas federales para los metales pesados ​​en el cannabis, los estados donde el uso y la producción de cannabis son legales tienen adoptado exposición límites y criterios de control de calidad para Arsénico, Cadmio, Mercurio, y liderar basado en USP<233>. Aquí informamos los resultados de nuestro análisis de muestrasis usando estas pautas. 

Métodos

La flor de cannabis se compró localmente y se molió finamente para su análisis. Las muestras se preparan utilizando un sistema de digestión por microondas (CEM Mars 6, Matthews, Carolina del Norte). validación del método para USP<233> se basa en la precisión, utilizando recuperaciones de picos, repetibilidad basados en el % RSD de seis réplicas digeridas de forma independiente, y la robustez, donde esas 6 réplicas son ejecutadas por segunda vez por otro analista, otro instrumento, o en otro día. Los niveles de pico se basan en el "nivel de acción" definido by Los límites máximos permitidos de exposición diaria (PDE) de California como guía: plomo 0.5 µg/g, arsénico y cadmio 0.2 µg/g y mercurio 0.1 µg/g se utilizan para definir el nivel de pico del 100 %. Las muestras también se enriquecen al 50 % y al 150 % del nivel de acción. 

Datos preliminares

Para la digestión, Se tratan 0.5 g (+/- 0.002 g) de muestra con 9 ml de solución conc. HNO3 y 1mL conc. HCl en un recipiente para microondas y se deja reaccionar para 15 minutos antes de ser tapado. Los recipientes se cargan en el carrusel en el microondas. y el método cannábico “one touch”, suministrado por CEM, es usado. Las muestras son llevado a 200°C en 30 minutos, retenido allí durante 10 minutos y se deja enfriar. El resultado es una solución clara y libre de partículas. La SOLACION® Se utilizó ICP-MS para analizar el cualquier para como, cd, Hg y Pb después de la digestión y dilución. El dE TRATAMIENTOS demostrar que la SOLACION® ICP-MS pudo producir valores precisos medido por las recuperaciones de picos que eran bien dentro de el rango de 70-150%.  Los resultados de los 6 resúmenes independientes tuvieron dentro de el límite definido de RSD del 20 %. Repita el análisis de los 6 resúmenes en un día separado mostró buen acuerdo con los resultados iniciales y tuvieron en la pestaña especificación RSD del 25 %. definido por USP<233>. Resultados totales mostrar que la SOLACION® ICP-MS es un eficaz instrumento para el análisis de muestras de cannabis y cáñamo.