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Análisis de Iohexol utilizando Advion Interchim Scientific AVANT™ HPLC y exprensaion® sistema CMS

Introducción

El iohexol es un agente de imagen no iónico ampliamente utilizado que mejora el contraste para el análisis de rayos X. Su baja osmolalidad permite un rápido aclaramiento a través del riñón, evitando la reabsorción y posterior metabolización.[ XNMUX ]. Esto convierte al iohexol en un compuesto con un mejor perfil de seguridad en comparación con otros agentes de diagnóstico por imágenes.[ XNMUX ]. 

En muchas aplicaciones de imágenes clínicas, los agentes de imágenes/agentes de contraste se administran a los pacientes para mejorar el contraste y la resolución espacial de la exploración. Debido a la toxicidad y los efectos secundarios del agente de formación de imágenes, las preparaciones de sus concentraciones conocidas y su análisis de pureza son muy importantes para su uso seguro y un diagnóstico preciso. 

En esta nota de aplicación, se presenta un método HPLC-CMS simple y preciso para el análisis de iohexol.

Método

Configuración del método

Todos los disolventes utilizados en la aplicación eran de grado HPLC.

Se obtuvieron dos estándares de Iohexol de Sigma Aldrich.

Uno era un material de referencia certificado con una pureza del 99.99 %, el segundo tenía una pureza declarada de ≥ 95 %.

Todos los experimentos se realizaron en un Advion Interchim Scientific exprensaion® Espectrómetro de masas compacto acoplado con un sistema UHPLC AVANT™ con parámetros como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Método HPLC/MS

Análisis HPLC/UV/MS de Iohexol

A temperatura ambiente, el iohexol se isomerizará y se detectarán dos picos en su análisis HPLC/UV/MS. 

Estos dos picos (Figura 1A) provienen de la rotación impedida del grupo anilida N-acetilo debido a los voluminosos átomos de yodo unidos al anillo de benceno central del iohexol. Esos dos compuestos son esencialmente "isómeros rotacionales" que se intercambian lentamente a temperatura ambiente en solución acuosa.

Ambos picos se confirman con el análisis de MS para mostrar la misma m/z a 821.9 (Figura 1B y 1C) y no se observaron diferencias en sus espectros de masas CID en la fuente (Figura 2A y 2B). 

Dado que ambos rotámeros contribuyen a la toxicidad de los compuestos y a las capacidades de mejora de la imagen en el análisis de rayos X, la suma de ambos picos se utilizará para cualquier análisis adicional de iohexol en esta nota de aplicación. 


Figura 1: (A) cromatograma HPLC (254 nm) de iohexol, (B) el cromatograma iónico de extracción de iohexol protonado am/z 821.8, (C) los espectros de MS promediados desde el pico a RT 4.06 min.


Figura 2: (A) Los espectros de masas CID en fuente promediados desde el pico a RT 3.61 min, (B) Los espectros de masas CID en fuente promediados desde el pico a RT 4.06 min.

Determinación de pureza por análisis HPLC/UV

Al comparar la respuesta de HPLC de la muestra de iohexol con la respuesta del estándar certificado de iohexol a una concentración similar, la relación del área del pico de la muestra al estándar certificado puede proporcionar un análisis rápido de concentración y pureza. 

La ecuación para calcular la relación de concentración de iohexol se muestra a continuación:

Los cromatogramas de HPLC de la muestra de iohexol y la referencia certificada se muestran en las Figuras 3A y 3B.

El valor promedio de las áreas de dos picos sumadas es 714 para la muestra de iohexol (Figura 3A) y 740 para el estándar de referencia de iohexol (Figura 3B). Con el cálculo de la relación de concentración, la concentración calculada de iohexol en la muestra es de 0.0964 mg/ml, lo que equivale a una pureza del 96.4 %, en línea con la pureza del producto declarada de ≥ 95 %.


Figura 3: (A) Cromatograma HPLC (254 nm) de muestra de iohexol (0.1 mg/ml) (B) Cromatograma HPLC (254 nm) de patrón de referencia de iohexol (0.1 mg/ml).

Cuantificación por HPLC/Análisis UV

Para verificar la pureza de una muestra de iohexol con mayor precisión, se creó una curva de calibración del material estándar certificado de iohexol con cinco niveles de dilución diferentes de 25 a 500 μg/mL y con inyecciones por triplicado para cada concentración. El valor R-cuadrado de la función de calibración lineal resultante es 0.9999 (Figura 4), lo que muestra una linealidad excelente. 

Mediante el enfoque de la curva de calibración de iohexol, se determinó que la pureza de la muestra de iohexol era del 97.5 %. 

Este valor también está justo por encima de la pureza indicada de un mínimo del 95 % de la muestra y difiere en solo un 1.1 % del valor medido mediante el análisis directo de la relación de respuesta UV de la muestra de iohexol al estándar de referencia de iohexol.

Tanto la determinación de la pureza mediante una función de calibración como el análisis directo de la relación de respuesta UV se pueden utilizar para productos químicos orgánicos con absorbancias UV si se dispone de material estándar de referencia certificado.

El método de la función de calibración proporcionará una medición más precisa.


Figura 4: Curva de calibración de iohexol por cromatograma HPLC (254 nm)

Conclusión

El sistema Advion Interchim Scientific AVANT™ (U)HPLC puede proporcionar métodos cromatográficos precisos para el análisis de pureza de los agentes de formación de imágenes, como se muestra para el iohexol. Acoplamiento de UHPLC con Advion Interchim Scientific exprensaion® El espectrómetro de masas compacto no solo proporciona confirmaciones de compuestos objetivo a través de su masa y patrón de fragmentación en la fuente, pero también permite una rápida determinación de las impurezas. 

Referencias
[ XNMUX ] T. Almen, Desarrollo de medios de contraste no iónicos., Invest. Radiol. (1985) Radiología de investigación. 1985, 20(1), S2-S9.
[ XNMUX ] RD Moore, EP Steinberg, NR Powe, RI White, JA Brinker, EK Fishman, SJ Zinreich, CR Smith, Frecuencia y determinantes de las reacciones adversas inducidas por medios de contraste de alta osmolalidad, Radiología. 1989, 170, 727-32.

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Extracción y purificación de 3 curcuminoides a partir de polvo de cúrcuma

Instrumentación:
Destello: puriFlash® XS520
TLC: Plate Express™ Lector de placas TLC
Espec. de masa: exprensaion® Espectrómetro de masas compacto
Muestreo: Lo antes posible® Sonda de análisis directo

Introducción

Los curcuminoides son compuestos de polifenoles naturales derivados de la raíz de cúrcuma (Curcuma longa). Se informa que tienen actividades antioxidantes.1. La curcumina es el principal curcuminoide que se encuentra en la cúrcuma. Se usa comúnmente como ingrediente en suplementos dietéticos y cosméticos, saborizante en platos culinarios y colorante alimentario de color amarillo anaranjado.

En esta nota de aplicación, un método para separar y purificar 3 curcuminoides del polvo de cúrcuma mediante cromatografía flash con Advion Interchim Scientific puriFlash® XS520 Plus, TLC con espectrometría de masas con Plate Express™ TLC Plate Reader y exprensaion® Se demuestra CMS. Las fracciones se identificaron utilizando la sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP®).

Extracción de curcuminoides

El polvo de cúrcuma se pesó (57.3 g) y se transfirió a una botella de vidrio de boca ancha. Se añadió etanol (250 ml, graduación 200) a la botella y la mezcla se agitó durante 18 horas mientras se tapaba con papel aluminio. Los compuestos de interés son sensibles a la luz. A continuación, la suspensión se filtró y el filtrado se concentró a sequedad para formar un aceite de color ámbar (6.4 g).

Figura 1: Estructuras de curcuminoides.

Figura 2: Polvo de cúrcuma comprado en la tienda (izquierda) y aceite de extracto crudo (derecha).

Análisis TLC/MS

El Advion Interchim Scientific Plate Express™ combinado con el exprensaion® CMS permite una fácil identificación de puntos en placas de TLC sin necesidad de purificación o preparación de muestras (Figura 3).

El análisis TLC inicial mostró 4 puntos (diclorometano:metanol, 97:3). Los tres puntos inferiores eran muy fluorescentes, como se esperaba para los curcuminoides de interés. Los puntos de TLC se analizaron mediante ionización APCI en modo de iones negativos. Los 3 puntos inferiores se caracterizaron por espectrometría de masas.

Figura 3: Advion Interchim Scientific exprensaion® Lector de placas TLC CMS y Plate Express™ (izquierda) y primer plano del cabezal de extracción de placas TLC (derecha).

Figura 4: Placa TLC revelada visualizada a 365 nm. Espectros de masas resultantes de curcumina (arriba), demetoxicurcumina (centro) y bisdemetoxicurcumina (abajo).

Purificación instantánea

Se usó un método isocrático ya que la separación que se muestra en TLC era óptima tal cual. El material bruto se purificó en una columna de gel de sílice esférica de 25 g y 15 μm (PF-15SIHC-F0025). Se cargó en seco un peso bruto de 64 mg en 500 mg de gel de sílice y se cargó en un cartucho de carga seca de 4 g (PF-DLE-F0004).

Figura 5: Cromatograma flash resultante de la placa TLC desarrollada.

Identificación de fracciones por ASAP®/CMS

La exprensaion® CMS con el ASAP® La sonda de análisis directo permite una fácil identificación de compuestos sin necesidad de LC/MS o preparación de muestras.

Las fracciones puras (1.1, 1.3 y 1.5) se analizaron utilizando el ASAP® sonda con ionización APCI y CMS de polaridad positiva. Sin embargo, los curcuminoides se ionizan bien tanto en polaridad positiva como negativa de APCI (M+H)+ los iones mostraron menos fragmentación. Las masas detectadas son consistentes con el teórico [M+H]+ valores m/z.

Figura 6: Advion Interchim Scientific lo antes posible® La sonda de análisis directo se inserta directamente en la fuente de iones habilitada para APCI del exprensaion® CMS.

Figura 7: Espectros de masas de fracciones.

Las fracciones purificadas se concentraron a sequedad para dar los sólidos I (14.1 mg), II (5.6 mg) y III (6.7 mg) respectivamente, que representan curcumina (I), demetoxicurcumina (II) y bisdemetoxicurcumina (III) al 53.4 %. 21.2%, y 25.3% del perfil curcuminoide aislado. Estos resultados son consistentes con los valores reportados en la literatura.2.

Confirmación de la pureza del compuesto por RP-HPLC

Figura 8: Escaneo UV de la mezcla de fracción purificada.

La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) permite una confirmación separada de la pureza del compuesto después de la cromatografía flash. Se combinó una mezcla igual de los tres compuestos y se ejecutó en un Phenomenex Kinetex® 5 μColumna de bifenilo m 100 Å 50 x 2.1 mm usando ACN isocrático:agua (v:v, 55:45) con ácido fórmico al 0.2%. Como era de esperar, el orden de elución de los tres curcuminoides cambió de orden ahora eluyendo III, II e I (Figura 8). Después de desarrollar este método, se inyectó la respectiva fracción única recolectada y se analizó la pureza y se confirmó nuevamente mediante análisis de MS.

Figura 9: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.1.

Figura 10: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.3.

Figura 11: Escaneo UV y espectro de masas de Curcumina Fracción 1.5.

En resumen

Con una combinación de cromatografía TLC, cromatografía flash y soporte de espectrometría de masas en varias etapas del proceso (identificación de placa TLC, confirmación de fracción y análisis de pureza secundario), podemos purificar curcuminoides a partir de polvo de cúrcuma a niveles de pureza confirmados de >95 %.

Referencias:
1Jayaprakasha et al. Actividades antioxidantes de la curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina. Food Chemistry, volumen 98, número 4, 2006, páginas 720-724. ps://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.06.037.
2Praveen et al. Enfoque sencillo de RMN para perfilar los curcuminoides presentes en la cúrcuma, Food Chemistry, volumen 341, parte 2, 2021, 128646, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.128646.

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Análisis de suelos con Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS

Introducción

Los contaminantes ambientales generados por las actividades humanas o industriales a menudo llegan al suelo a través de las aguas de escorrentía o la deposición del aire. Estos contaminantes pueden ser absorbidos por las plantas y avanzar en la cadena alimenticia, lo que puede tener impactos significativos en la salud humana y animal. Por lo tanto, no solo es importante monitorear los niveles de nutrientes esenciales en el suelo que son clave para el crecimiento saludable de las plantas, sino que también es imperativo monitorear los niveles de contaminantes.

En esta nota de aplicación presentamos un método para el análisis de rutina de 21 elementos usando SOLATION® Espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Se digirieron un grupo de muestras de suelo desconocidas y un CRM utilizando EPA 3051a y se analizaron de acuerdo con los requisitos del método 6020a.

Experimento

Reactivos y materiales
• Ácido nítrico (Aristar Plus, grado de metales traza)
• Ácido clorhídrico (Aristar Plus, grado de metales traza)
• Agua, tipo 1 (18.2 MΩ, sistema de punto de uso Elga o equivalente)
• NIST CRM2706 “Suelo de Nueva Jersey, Orgánicos y Oligoelementos”
• Solución multielemento Spex 'CL-ICV-1'
• Solución estándar de aluminio (1000 μg/ml, grado Claritas ppt)

Instrumentación
1. Anton Paar Multiwave 5000 con el rotor 20SVT50 (20 posiciones, recipientes de 50 ml que ventilan a 40 bar (580 psi)
2. Amoladora multifunción de alta velocidad OKF
3. Advion Interchim Scientific SOLACIÓN® ICP-MS

Estándares

Los estándares de calibración se prepararon en las mismas proporciones de ácido que las muestras digeridas (9mL HNO3+ 3 ml de HCl, o 3:1). Un litro de HNO al 3%3Se hizo + HCl al 1% como diluyente para los estándares, para la dilución final de las muestras y para usar como blanco de calibración.

Los estándares se hicieron utilizando la solución multielemento Spex 'CL-ICV-1' y el estándar de aluminio de un solo elemento. El aluminio se agregó por separado a la mezcla para dar cuenta de los altos niveles de este elemento en el suelo.

Muestras y Preparación

Se secaron cuatro muestras de suelo a 60°C durante la noche, luego se molieron finamente usando un molinillo multifunción de alta velocidad OKF para hacer una mezcla homogénea. Según el método EPA 3051a "Digestión ácida de sedimentos, lodos y suelos asistida por microondas", se transfirieron 0.5 g de cada muestra a recipientes de microondas y se mezclaron con 9 ml de ácido nítrico y 3 ml de ácido clorhídrico. A continuación, los recipientes se taparon y se hicieron funcionar utilizando el método descrito en la Tabla 1. Después de la digestión, las muestras se filtraron y se llevaron al volumen con agua desionizada en una volumétrica de 50 ml. Luego se diluyó una alícuota de 1.0 ml hasta un volumen final de 50 ml con el diluyente preparado para una dilución final nominal de 5,000x dependiendo del peso inicial de la muestra.

Tabla 1: Programa de digestión por microondas.

Para fines de control de calidad, las cuatro muestras de suelo desconocidas se prepararon como muestra, duplicado y espiga. Se digirieron de forma independiente donde los dos primeros se usaron para comparar la repetibilidad de la preparación de la muestra, mientras que el tercero se añadió antes de la digestión para establecer la recuperación del analito del procedimiento de digestión.

Para verificar la precisión de los resultados, incluimos el material de referencia estándar, NIST 2706 "Suelo, compuestos orgánicos y elementos traza de Nueva Jersey", que incluye valores certificados para todos los analitos informados en este estudio.

Las muestras se analizaron mediante un SOLATION® ICP-MS. La SOLACION® configuración del instrumento para este análisis fue una cámara de pulverización ciclónica con un Micromist® nebulizador concéntrico y una antorcha de una pieza. Durante todo el estudio se utilizaron conos de muestreo y skimmer de Ni. Los parámetros de operación del plasma fueron:

Tabla 2: Parámetros de funcionamiento del plasma.

Método ICP-MS

Integral a la SOLACIÓN® ICP-MS es una celda de colisión octupolar que se utiliza para abordar las interferencias de los iones poliatómicos, especialmente para los elementos de metales de transición. Es fundamental para un análisis de elementos traza robusto y rutinario que la celda del octupolo no se contamine, lo que podría causar deriva y tiempo de inactividad innecesario. Por lo tanto, el camino iónico de la SOLACIÓN® ICP-MS fue diseñado para tener la celda de colisión fuera de la línea directa del plasma. Los iones que pasan a través de la interfaz se dirigen a través de un giro de 90 ̊ y se enfocan hacia la entrada del octupolo usando un deflector de cuadrupolo (QD). Las partículas ligeras y neutras continúan a través del QD y se alejan de la celda.

La celda de colisión en la SOLACIÓN® El ICP-MS puede funcionar en el modo "He Gas", en el que la celda se llena con He para que actúe como gas de colisión, o en el modo "Sin gas", en el que la celda está vacía. El modo “He Gas” se utiliza para isótopos sujetos a interferencias poliatómicas mientras que el modo “No Gas” se utiliza para el resto de isótopos. El cambio rápido entre los modos "He Gas" y "No Gas" en SOLATION® (< 5 seg) garantiza que las corridas analíticas se mantengan cortas, mejorando así la productividad.

El flujo de helio utilizado para el modo “He Gas” en esta aplicación fue de 6 ml/min. La Tabla 3 enumera los elementos utilizados para este análisis y sus isótopos, y el modo utilizado para cada uno.

Tabla 3: Una lista de los elementos incluidos en este estudio junto con sus isótopos y el modo de gas utilizado para el análisis.

Resultados y discusión

Los resultados resumidos en la Figura 1 muestran una excelente concordancia entre los datos medidos para CRM2706 y los niveles extraídos informados para estos elementos. Se observó una recuperación ligeramente mayor para K y Al, posiblemente debido a la variabilidad en la eficiencia de extracción de este método de digestión.

Figura 1: Datos de recuperación de materiales de referencia certificados.

Como se muestra en la Tabla 4, las recuperaciones de pico promediaron entre 75% y 125% para todos los elementos, con la excepción de Al; Esto probablemente se debió al pequeño tamaño del pico en comparación con los niveles de Al en las muestras. Incluidos en la misma tabla están los resultados de las digestiones/análisis por duplicado para estos elementos. En promedio, los duplicados tenían una diferencia de menos del 20 % y la mayoría de los elementos mostraban una excelente repetibilidad de <5 %.

Tabla 4: Recuperaciones promedio de picos y repetibilidad por duplicado para las diversas muestras.

Resumen

En este informe de aplicación, informamos sobre el análisis de oligoelementos en el suelo utilizando Advion Interchim Scientific SOLATION® ICP-MS. Se observaron recuperaciones excelentes tanto para las muestras enriquecidas como para los CRM. La combinación del deflector cuadripolar y la celda de colisión minimiza la deriva y garantiza la exactitud y la precisión a lo largo del tiempo. El método informado se beneficia de las capacidades de cambio de gas de celda de colisión rápida de SOLATION® para analizar una amplia gama de elementos en el suelo para obtener resultados rápidos, precisos y reproducibles.

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Colección de fracciones dirigidas a la masa de productos naturales: ejemplos de extracto de cúrcuma y té verde

Flash: PuriFlash® 5.250
Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: lo antes posible® sonda

Introducción

La cromatografía ultrarrápida ha utilizado tradicionalmente la absorción UV como método principal de detección de compuestos durante un proceso de purificación. Mientras que la absorción UV es ampliamente aplicable a muchas clases de compuestos, tiene una especificidad limitada para los compuestos individuales en una mezcla y pasa por alto las clases de compuestos que no llevan cromóforos.

La recolección de fracciones dirigida por masa brinda a los usuarios la capacidad de recolectar fracciones basadas en la detección de espectrometría de masas (MS), que se basa en iones específicos de compuestos individuales y proporciona información molecular específica. Esto permite la simplificación del proceso de purificación general y una mayor confianza en la identidad de cada compuesto aislado.

Aquí describimos métodos para aislar productos naturales a partir de té verde y polvo de cúrcuma mediante la recolección de fracciones dirigidas a la masa durante la cromatografía flash y la CL preparativa. Con fines de demostración, los compuestos aislados se confirmaron adicionalmente mediante la sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP®) MS o HPLC-MS.

Introducción a los curcuminoides

La curcumina es el principal curcuminoide que se encuentra en la raíz de la cúrcuma (Curcuma longa). Se usa comúnmente como ingrediente en suplementos dietéticos y cosméticos, saborizante en platos culinarios y colorante alimentario de color amarillo anaranjado. Se ha informado que los curcuminoides tienen actividades antioxidantes y antiinflamatorias.

El polvo de cúrcuma comprado en la tienda (57.3 g) se extrajo en etanol, luego se filtró a través de papel de filtro y se concentró. Esto produjo un aceite de extracto crudo de 6.4 g que contenía los tres curcuminoides de interés (compare también el análisis de TLC en la Figura 4).


Figura 1: Estructuras de los curcuminoides de interés.


Figura 2: Polvo de cúrcuma comprado en la tienda.


Figura 3: Aceite de extracto crudo de polvo de cúrcuma.


Figura 4: Análisis TLC a 365 nm de extracto de cúrcuma (97:3 DCM:MeOH) y el cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección UV.

Desarrollo de métodos

El extracto de cúrcuma se analizó primero en una placa TLC y luego el método se transfirió al puriFlash® Sistema 5.250 que utiliza detección UV en dos longitudes de onda. Se detectaron cuatro compuestos a 254 nm con tres supuestos curcuminoides detectados a 427 nm, sin embargo, no hay especificidad para los compuestos individuales en la detección UV.

Se utilizó un método isocrático (97:3 diclorometano:metanol) ya que la separación mostrada en TLC fue óptima. El material bruto se purificó en una columna de gel de sílice esférica de 12 g y 15 μm (PF-15SIHC-F0012). Se cargó en seco un peso bruto de 32 mg en 250 mg de gel de sílice y se cargó en un cartucho de carga seca de 4 g (PF-DLE-F0004). Las fracciones se recolectaron usando los canales XIC para cada compuesto de interés.


Figura 5: Captura de pantalla del método de cromatografía flash ejecutado con parámetros.

Los ajustes del espectrómetro de masas se controlan a través de InterSoft®Software X en el puriFlash® sistema. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente APCI y funcionó con el modo de adquisición de ionización negativa.


Figura 6: Captura de pantalla de los parámetros del espectrómetro de masas para la ejecución de la cromatografía.

Experimento

Colección de fracciones dirigidas a masas

El cromatograma de iones extraídos (XIC) creado al graficar la intensidad de la señal observada en un valor elegido de masa a carga. Esto permite una señal de bajo ruido de los compuestos de interés. Aquí los canales XIC están configurados para detectar los tres curcuminoides de interés.


Figura 7: Análisis TLC del extracto de cúrcuma (97:3 DCM:MeOH) y cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección MS XIC.




Figura 8: Los espectros de masas para cada pico proporcionados por el puriFlash® intersoft®programa X.

Lo antes posible® Confirmación de fracciones MS

Las fracciones puras (1.1, 1.2 y combinadas 1.3 y 1.4) se analizaron adicionalmente usando ASAP® EM de polaridad negativa. Las masas detectadas son consistentes con los valores teóricos [MH]-m/z.




Figura 9: Los espectros de masas de los compuestos aislados confirmando su identidad y pureza.

Introducción, Catequinas del té verde

El té verde seco generalmente consta de 10 a 30 % de polifenoles en base al peso seco, siendo las catequinas los principales polifenoles del té, incluidos: (-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), (-) -epicatequina-3-galato (ECG) y (-)-galocatequina galato (GCG). EGCG es la catequina más abundante y biológicamente activa, la separación y purificación de las catequinas del extracto de té crudo puede aumentar considerablemente su disponibilidad y valor en el mercado.

Las hojas secas de té verde se extrajeron en agua caliente, luego se repartieron con acetato de etilo, se filtraron a través de papel de filtro y se evaporaron para dar un extracto crudo. Luego, el extracto seco se disolvió en 7.5 ml de agua y se filtró con un filtro de 0.2 μm antes de continuar con el procesamiento.


Figura 10: Hojas de té verde en remojo.


Figura 11: Principales catequinas en el té verde.

Desarrollo de métodos
Con el análisis HPLC-UV/MS, se detectan EGC, EGCG, GCG, EC y ECG en el extracto de té (Figura 12).

Disolvente A: Agua
Disolvente B: Metanol
ultravioleta: 275nm
MS: escaneo completo de 150-900
Columna: US15C18HP-250/046


Figura 12: Se utilizó el cromatograma HPLC-UV del extracto de té verde, datos de MS y un estándar para EGCG para la confirmación del compuesto (datos no mostrados).

Los ajustes del espectrómetro de masas se controlan a través de InterSoft®Software X en el puriFlash® sistema. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente ESI y funcionó con el modo de adquisición de ionización negativa.


Figura 13: Captura de pantalla de los parámetros del espectrómetro de masas para la ejecución de la cromatografía.

Colección de fracciones dirigidas a masas
Aquí los canales XIC están configurados para detectar las 4 catequinas de interés. EGCG y CGC son isómeros y por lo tanto comparten la misma masa.


Figura 14: Cromatograma del método transferido al puriFlash® 5.250 usando detección MS XIC.


Figura 15: Los espectros de masas para cada pico proporcionados por InterSoft®programa X.

En resumen

• Con el aislamiento de productos naturales, uno de los mayores desafíos es la identificación de compuestos de interés en mezclas de extractos complejos.
• Usando MS y cromatografía en tándem, podemos separar e identificar compuestos en una mezcla compleja con un alto grado de pureza y precisión sin necesidad de una mayor identificación de las fracciones recolectadas.
• Las fracciones recolectadas se pueden caracterizar directamente a través de los datos de MS proporcionados por InterSoft®Software X en el puriFlash® .
• El puriFlash® 5.250 y exprensaion® CMS forma un poderoso dúo en la purificación e identificación de productos naturales como las catequinas que se encuentran en el té verde y los curcuminoides que se encuentran en la cúrcuma.

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Purificación de alto rendimiento de cinco compuestos de medicamentos recetados y de venta libre mediante LC-MS preparativa de fase inversa

Instrumentación:

puriFlash® 5.250
exprensaion® CMS
Uptisfera® Columna StrategyTM US5C18HQ-150/300

Escritores:

Advion Interchim Scientific, Montluçon, Francia Sede

 

Introducción

La purificación es un paso crítico en el desarrollo de fármacos. Desde la investigación hasta la ampliación y el procesamiento, la purificación y la confirmación son pasos esenciales para llevar un fármaco al mercado. Es esencial contar con una solución de alto rendimiento que ofrezca una cantidad suficiente y una calidad reproducible de compuestos purificados. La separación de los ingredientes farmacéuticos activos (API) de sus impurezas se puede lograr fácilmente con un sistema de cromatografía preparativa.

Esta nota de aplicación presenta la purificación de cinco ingredientes activos que se encuentran en los medicamentos de venta libre (OTC), incluidos la cafeína, la glafenina, el ketoprofeno, la flavona y el fenofibrato (Figura 1), mediante un flujo de trabajo de purificación preparativa con confirmación mediante un espectrómetro de masas compacto.

Figura 1: Los cinco compuestos de interés incluyen cafeína, glafenina, ketoprofeno, flavona y fenofibrato. Las estructuras químicas y los casos de uso farmacéutico se destacan a continuación.

Cafeína: Una sustancia química natural con efectos estimulantes, la cafeína se puede encontrar purificada en forma de tabletas o de forma natural en el café, el té, el cacao y más.

Glafenina: Un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), la glafenina, se retiró del mercado en 1991 debido al alto riesgo de anafilaxia.

Ketoprofeno: Un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) de venta con receta, el ketoprofeno se utiliza para tratar inflamación, hinchazón, rigidez y dolor en las articulaciones. El medicamento se suspendió en 1995 debido al aumento del riesgo de ataque cardíaco, accidente cerebrovascular, irritación y otros problemas.

Flavona: Un metabolito y nematicida que existe comúnmente en las plantas.

Fenofibrato: Medicamento recetado que se usa para reducir y tratar los niveles altos de colesterol y triglicéridos (sustancias similares a las grasas) en la sangre.

Experimento

Separación LC exploratoria

Figura 2: Para confirmar la presencia de los compuestos preidentificados, una serie LC-UV exploratoria confirmó la presencia de los compuestos farmacológicos antes de la purificación.

Ejecución de LC preparativa

Después de la identificación positiva de los cinco compuestos de interés y sus puntos de elución, la mezcla de fármacos estaba lista para una ejecución preparatoria de LC-UV en el puriFlash.® 5.250 iELSD. El paquete iELSD ayuda a la purificación, lo que permite la detección de compuestos libres de cromóforos (Figura 3).

Resultados y Validación

Resultados de separación y purificación

La identidad de los compuestos separados se confirmó utilizando el Advion Interchim Scientific exprensaion® Espectrómetro de masas compacto, que identifica de forma rápida y precisa los compuestos de interés.

La pureza de estos compuestos se puede verificar mediante HPLC a escala analítica.

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SOLATION®, un nuevo ICP-MS para la detección de metales pesados ​​en el cannabis y el cáñamo

Introducción

Los productos de cannabis y cáñamo son cada vez más Hoy Disponibles es uso medicinal y recreativo hacer pruebas de rutina para metales pesados ​​tóxicos mucho mas importante.  Advion Interchim Scientific presenta SOLATION® ICP-MS para el analisis de metales pesados ​​en muestras de plantas de cannabis y productos de cannabis. Si bien no existen pautas federales para los metales pesados ​​en el cannabis, los estados donde el uso y la producción de cannabis son legales tienen adoptado exposición cupos y criterios de control de calidad para Arsénico, Cadmio, Mercurio, y liderar basado en USP<233>. Aquí informamos los resultados de nuestro análisis de muestrasis usando estas pautas. 

Métodos

La flor de cannabis se compró localmente y se molió finamente para su análisis. Las muestras se preparan utilizando un sistema de digestión por microondas (CEM Mars 6, Matthews, Carolina del Norte). validación del método es USP<233> se basa en la precisión, utilizando recuperaciones de picos, repetibilidad basados en el % RSD de seis réplicas digeridas de forma independiente, y la robustez, donde esas 6 réplicas son ejecutadas por segunda vez por otro analista, otro instrumento, o en otro día. Los niveles de pico se basan en el "nivel de acción" definido by Los límites máximos permitidos de exposición diaria (PDE) de California como guía: plomo 0.5 µg/g, arsénico y cadmio 0.2 µg/g y mercurio 0.1 µg/g se utilizan para definir el nivel de pico del 100 %. Las muestras también se enriquecen al 50 % y al 150 % del nivel de acción. 

Datos preliminares

Para la digestión, Se tratan 0.5 g (+/- 0.002 g) de muestra con 9 ml de solución conc. HNO3 y 1mL conc. HCl en un recipiente para microondas y se deja reaccionar para 15 minutos antes de ser tapado. Los recipientes se cargan en el carrusel en el microondas. y el método cannábico “one touch”, suministrado por CEM, es usado. Las muestras son llevado a 200°C en 30 minutos, retenido allí durante 10 minutos y se deja enfriar. El resultado es una solución clara y libre de partículas. La SOLACION® Se utilizó ICP-MS para analizar el cualquier para como, cd, Hg y Pb después de la digestión y dilución. El dE TRATAMIENTOS demostrar que la SOLACION® ICP-MS pudo producir valores precisos medido por las recuperaciones de picos que eran bien dentro de el rango de 70-150%.  Los resultados de los 6 resúmenes independientes tuvieron dentro de el límite definido de RSD del 20 %. Repita el análisis de los 6 resúmenes en un día separado mostró buen acuerdo con los resultados iniciales y tuvieron en la pestaña especificación RSD del 25 %. definido por USP<233>. Resultados totales mostrar que la SOLACION® ICP-MS es un eficaz instrumento para el análisis de muestras de cannabis y cáñamo.

 

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Recolección masiva de fracciones de productos naturales: ejemplos de extracto de cúrcuma y té verde

Introducción

Los productos naturales han sido una fuente de inspiración para el descubrimiento de fármacos preclínicos tanto para explorar las medicinas tradicionales como para descubrir nuevos espacios en la farmacología. El aislamiento y la caracterización de productos naturales sigue siendo una barrera importante en el descubrimiento de fármacos. El aislamiento generalmente se realiza a escala analítica y luego los compuestos se caracterizan completamente antes de intentar cualquier purificación a escala. La capacidad de purificar compuestos en mezclas complejas de productos naturales mediante datos de MS altamente específicos permite simplificar los pasos de purificación y caracterización del proceso. Aquí, la cromatografía flash y de preparación se combinan con la detección de MS para purificar productos naturales en extractos de té verde y cúrcuma. 

Métodos

El aislamiento de las principales catequinas del té verde y los principales curcuminoides de la cúrcuma se completó mediante extracciones. Se extrajeron hojas de té verde y el material crudo se analizó mediante UPLC-MS y estándares analíticos para identificar las catequinas de interés y desarrollar un método de prep-LC adecuado para el aislamiento. El polvo de cúrcuma se extrajo y luego se analizó por TLC-MS usando Advion's Plate Express™ para identificar los compuestos de interés y desarrollar un método de cromatografía ultrarrápida adecuado para el aislamiento. Ambos extractos se purificaron utilizando la recolección de fracciones dirigidas a la masa utilizando el sistema de cromatografía flash/prep puriFlash 5.250 de Interchim conectado al ex de Advion.prensaion® espectrómetro de masas de un solo cuadrupolo. Los compuestos objetivo se detectaron usando canales XIC MS. A continuación, se determinó la pureza de los compuestos aislados usando HPLC-MS.

Datos preliminares

Pudimos aislar con éxito los 3 curcuminoides principales (curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina) en la cúrcuma y las 5 catequinas principales en el té verde ((-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epicatequina (EC), (-) -epigalocatequina-3-galato (EGCG), (-)-epicatequina-3-galato (ECG) y (-)-galocatequina galato (GCG) con alta pureza (≥95%).   

Se desarrolló un método de cromatografía ultrarrápida isocrática (97:3 DCM:MeOH) usando TLC (97:3 DCM:MeOH) para purificar los curcuminoides. La placa de TLC fue analizada por APCI– MS utilizando Plate Express, que extrae manchas directamente de la placa sin necesidad de preparación de la muestra. Las fracciones se recolectaron utilizando canales de cromatograma de iones extraídos (XIC) con APCI– SRA. Luego se caracterizaron las fracciones por ASAP– La MS y la pureza de cada fracción se determinaron usando HPLC-MS. 

Se desarrolló un método de CL preparativo para las catequinas del té verde utilizando HPLC-MS y estándares de referencia para identificar cada compuesto de interés. Usando un gradiente de metanol en agua y recolectando fracciones usando canales XIC establecidos para los compuestos de interés. Las fracciones se caracterizaron y su pureza se determinó por HPLC-MS. Se determinó que las fracciones de EGC, EGCG, GCG y ECG tenían purezas del 100 %, 99.8 %, 98.8 y 100 %, respectivamente.

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Presentamos el ICP-MS SOLATION® de Advion Interchim Scientific

Introducción

La SOLACION® El espectrómetro de masas de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) pone en sus manos el poder del análisis multielemental de trazas al simplificar y optimizar el flujo de trabajo típico de ICP-MS, por dentro y por fuera. El sistema ofrece análisis multielemental de alto rendimiento, ideal para aplicaciones medioambientales, clínicas, biomédicas, alimentarias, agrícolas y geológicas.   

La SOLACION® ofrece un deflector de cuadrupolo de última generación que garantiza que el analizador y el detector permanezcan limpios y mejora la S/N al evitar que los neutros y las partículas entren en el analizador. El sistema también está diseñado para un menor consumo de argón. 

La infraestructura clave del sistema incluye:

  • Conos de extracción de iones: extracción de iones de triple cono, seguida de una lente Einzel, que se controlan eléctricamente para maximizar la transmisión de iones al sistema de vacío. 
  • Bobina de RF: Generación de plasma con bobina de RF enfriada por agua que utiliza un generador de frecuencia variable estándar de la industria de 27 MHz para una adaptación rápida de la impedancia y el máximo rendimiento con matrices desafiantes. 
  • Antorcha: Antorcha desmontable de una pieza con conexión rápida en un solo paso de argón y encendedor. Escudo opcional para evitar descargas secundarias. 
  • Nebulizador: Nebulizador concéntrico de alta eficiencia disponible en vidrio o cuarzo para compatibilidad con la gama más amplia de caudales y composición de muestras. 
  • Cámara de pulverización: la cámara de pulverización ciclónica con control de temperatura opcional reduce aún más el tamaño de las gotas y la carga de disolvente para garantizar un plasma estable y eficiente. 
  • Bomba peristáltica: Bomba integrada de 4 canales y 12 rodillos para máxima flexibilidad y pulsaciones ultrabajas. Velocidad de flujo controlada por software de 1 μL/min a >1 mL/min. 
  • Válvula de compuerta: Permite un mantenimiento y reemplazo rápido y fácil de los conos mientras mantiene la integridad del vacío. 
  • Deflector de cuadrupolo de 90°: asegura que el analizador y el detector no estén alineados con el haz de plasma, lo que evita que los neutros y las partículas entren en el analizador, mejora la S/N y evita la contaminación. 
  • Celda de colisión octupolar: actúa como una guía de iones y una celda de colisión con gas He para proporcionar Discriminación de energía cinética (KED) para eliminar interferencias. 
  • Analizador de cuadrupolo: diseño de filtro de masa de alta frecuencia con la mayor estabilidad para maximizar simultáneamente la transmisión, la resolución y la sensibilidad de abundancia. 
  • Detectores de doble función: Mide tanto en modo analógico como de detección de pulsos con transmisión continua entre los dos, para permitir la medición de niveles altos y bajos en un solo análisis con más de 9 órdenes de magnitud de rango dinámico lineal. 
  • Detección de pulso: captura iones que generan pulsos de menos de 20 ns; preciso y lineal a un tiempo de permanencia mínimo de menos de 100 μs 
  • Detección analógica: se utiliza para señales de iones más altos mientras que la detección de pulsos está desactivada para prolongar la vida útil del detector. 
  • Control de software dependiente de la masa: software diseñado para optimizar rangos de masa específicos de forma independiente para permitir la optimización de sintonía específica de masa.  

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Análisis de metales pesados ​​en el cannabis utilizando SOLATION® ICP-MS

Instrumentación: SOLATION® ICP-MS

INTRODUCCIÓN

Con la creciente aceptación y legalización del cáñamo y el cannabis en los EE. UU., Canadá y varios otros países, los productos de cannabis están más disponibles que nunca. Ahora aprobado para usos médicos, recreativos y de suplementos de salud, el aumento de la producción y el consumo han puesto de relieve la necesidad de realizar pruebas de rutina y desarrollar estándares de prueba para sustancias químicas tóxicas, incluidos metales pesados, en el material vegetal de cannabis y todos los subproductos elaborados a partir de ellos, para garantizar productos seguros para el consumidor.  Con la adopción de los capítulos <232> y <233>, la Farmacopea de EE. UU. (USP) especifica una lista de elementos y límites de exposición máxima basados ​​en la toxicidad y las vías de administración de los productos farmacéuticos.  

Muchos estados que han legalizado el cannabis medicinal y recreativo basan sus límites de exposición en los valores de la USP.  California, Colorado y Massachusetts son ejemplos con límites de exposición diaria permitida (PDE) por inhalación de As, Cd, Hg y Pb. Estos valores se resumen en la Tabla 1. 

Tabla 1: Límites de PDE para los estados que utilizan las pautas de la USP para la exposición a metales pesados ​​por inhalación. USP <233> también define la precisión, repetibilidad y solidez requeridas para el análisis de estos elementos tóxicos:

Criterios de validación

Precisión: La matriz y los materiales bajo investigación deben enriquecerse con elementos objetivo en concentraciones que sean 50%, 100% y 150% de la exposición diaria máxima permitida (PDE). Las recuperaciones de picos medios para cada elemento objetivo deben estar dentro del 70% -150% del real.

Repetibilidad: Se deben agregar seis muestras independientes del material bajo investigación al 100% de los límites objetivo definidos y analizados. La desviación estándar relativa porcentual medida (% RSD) no debe exceder el 20% para cada elemento objetivo.

Rugosidad: Realización del procedimiento de prueba de medición de repetibilidad analizando las seis soluciones de prueba de repetibilidad, ya sea en días diferentes, con un instrumento diferente o por un analista diferente. El% RSD de las 12 réplicas debe ser inferior al 25% para cada elemento objetivo.

En este estudio, utilizamos Advion SOLATION® ICP-MS y un sistema de digestión por microondas para digerir y analizar muestras de cáñamo utilizando los métodos de validación descritos en el Capítulo General de la USP <233>.  La sensibilidad, la capacidad de manejar matrices complejas y la capacidad de eliminar las interferencias con una celda de colisión de helio lo convierten en el sistema ideal para el análisis de metales pesados ​​en la industria del cannabis.

EXPERIMENTAR

Preparación de la muestra

Se compró localmente una muestra de flor de cáñamo medicinal.  Aproximadamente 14 gramos se molieron finamente y se homogeneizaron, luego se pesaron 0.5 g +/- 0.005 g en recipientes de digestión y se añadió la cantidad apropiada de una solución de picos.  Se agregaron nueve ml de HNO3 concentrado y 1 ml de HCl concentrado a cada recipiente y las muestras se dejaron reaccionar durante 15 minutos antes de sellar y colocar los recipientes en el plato giratorio del sistema de digestión por microondas de recipiente cerrado.  El programa controla la energía de microondas de tal manera que las muestras aumentan hasta la temperatura de digestión óptima de 200 ° C durante 20 minutos, se mantienen a 200 ° C durante 10 minutos y luego se enfrían de nuevo a temperatura ambiente.  

Este método dio como resultado la digestión completa de todas las muestras, lo que dio como resultado una solución transparente y sin partículas una vez que se llevó al volumen con agua de 18 MΩ en un matraz aforado de 50 ml.

Los estándares de calibración y los picos se basaron en los niveles de acción de la tabla 1.  El conjunto de muestras incluyó una muestra de cáñamo, un duplicado, los picos del 50%, 100% y 150%, y agujas de pino NIST 1575 para validar aún más los resultados, que se ejecutaron por duplicado.  Para la especificación de 'robustez' de la USP <233>, hubo 6 muestras del cáñamo 100% enriquecido.  Los valores de los picos se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Valores de pico basados ​​en los límites de acción definidos en USP <233>

Se realizó una segunda dilución 1: 4 después de la digestión para llevar la concentración de ácido final al 5% para un factor de dilución total de 400x.  El blanco de calibración y los estándares se prepararon utilizando la misma concentración de ácido, 5% de HNO 9: 13/ HCl, para el emparejamiento de matrices.  Para estabilizar el mercurio y ayudar con el lavado, se agregó oro a 20 veces la concentración de mercurio.  Los estándares internos se agregaron a todas las muestras, estándares y blanco para una concentración final de 10 ng / g (ppb).  Las concentraciones estándar y los estándares internos se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Analizar masas, patrones de calibración y patrones internos.

Instrumentación

La SOLACIÓN Advion® ICP-MS incorpora un generador de estado sólido robusto, óptica iónica ortogonal para mantener limpios los componentes más sensibles de MS y un software de control y procesamiento de datos fácil de usar. 

Dado que se utilizó HCl en la digestión de la muestra, hay una cantidad significativa de cloro presente que crea una interferencia isobárica en 75A partir de 40Ar35Cl+.  La celda de colisión elimina efectivamente la contribución que ArCl+ hace a la señal en m / z 75 aprovechando la discriminación de energía cinética (KED) para separar las interferencias poliatómicas de los iones del analito, lo que da como resultado una cuantificación precisa de niveles bajos de arsénico.  El arsénico es el único analito del conjunto con este tipo de interferencia, por lo que la celda de colisión no se usa para Cd, Hg o Pb.  

Para la introducción de la muestra se utilizó un nebulizador concéntrico de vidrio acoplado a una cámara de pulverización ciclónica, conectado a la antorcha estándar con un diámetro interior del inyector de 2 mm.  Los parámetros de funcionamiento del instrumento se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Parámetros de ICP-MS

RESULTADOS Y VALIDACIÓN

Resultados de muestra

Las concentraciones de mercurio y plomo en el cáñamo fueron menores que el estándar más bajo y todos los valores fueron menores que los límites de acción. Las muestras se prepararon y analizaron por duplicado, y el promedio de esos duplicados se muestra en la Tabla 5. De acuerdo con el requisito de robustez, las muestras se analizaron en días separados por dos analistas diferentes.

Tabla 5: Resultados de la muestra de cáñamo (promedio de la muestra y duplicado)

Precisión: Las muestras se enriquecieron al 50%, 100% y
150% del nivel de acción (Tabla 2 anterior) y el porcentaje de recuperaciones calculado. Las recuperaciones de picos estuvieron todas entre 92.5% y 114.1%, muy dentro del rango de 70-150% definido por el método USP.

Tabla 6: Precisión: recuperaciones de picos

Repetibilidad: Se añadieron seis muestras de cáñamo al 100% del nivel de acción y se digirieron. Los resultados que se resumen en la Tabla 7 muestran que el% RSD de las concentraciones medidas están entre 1.3% - 3.7%, lo que demuestra una repetibilidad muy por debajo del límite del 20%.

Tabla 7: Resultados de repetibilidad USP <233>

Rugosidad: El conjunto de muestras de repetibilidad fue preparado y analizado en un día diferente por un analista diferente. Los resultados de esa ejecución se combinan con la ejecución anterior para determinar la robustez. Los valores de robustez son similares a los valores de repetibilidad y el% RSD medido (2.4 - 4.0%) está cómodamente por debajo del límite del 25% definido por el método USP. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8: Resultados de robustez de USP <233>

Resultados de NIST 1575a

Los resultados del NIST SRM se resumen en la Tabla 9. Los valores de As y Hg fueron menores que
el estándar bajo en solución, pero existe una buena concordancia entre los valores experimentales y los valores certificados.

Tabla 9: NIST 1575a agujas de pino SRM

CONCLUSIÓN

Este estudio demuestra que Advion SOLATION® ICP-MS, junto con un sistema de digestión por microondas, es adecuado para el análisis preciso, robusto y reproducible de metales pesados ​​en material vegetal de cáñamo, superando en gran medida los requisitos del protocolo USP <233>.

La validación del método de digestión por microondas se vio reforzada por los excelentes resultados de recuperación obtenidos para el pino NIST SRM 1575.

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Análisis directo de muestras de bebidas gaseosas sin preparación de muestras en un espectrómetro de masas compacto

Especificación de masa: exprensaion® CMS
Muestreo: lo antes posible

INTRODUCCIÓN

Los químicos tienen la tarea de identificar rápidamente los compuestos creados, garantizar la calidad de los productos o evaluar la seguridad. Las técnicas actuales son adecuadas, pero no todas ofrecen la velocidad, la calidad de los datos o la facilidad de uso que ofrece Advion exprensaion® CMS. El CMS con Advion ASAP ofrece a los químicos la capacidad de analizar rápidamente sólidos, líquidos y polvos sin la tediosa y lenta preparación de muestras.

MÉTODO

El capilar de vidrio extendido del ASAP se sumergió en cada muestra de bebida gaseosa. El exceso se eliminó y la sonda se insertó directamente en la fuente de iones APCI habilitada para ASAP del CMS, produciendo resultados en segundos.

Figura 1: El ASAP que contiene la muestra directamente insertada en la fuente APCI habilitada para ASAP del CMS para su análisis.

Figura 2: Esquema de la sonda de muestreo ASAP para análisis APCI-CMS.

RESULTADOS

RESUMEN

El análisis ASAP / CMS proporcionó datos en <1 min sin preparación de muestras ni cromatografía, lo que lo hace ideal para el monitoreo de reacciones, identificación de compuestos, seguridad alimentaria y análisis de productos naturales.